L'œstrogène renforce l'intégrité des vaisseaux sanguins dans l'os pendant la grossesse et la ménopause

Nature Cardiovascular Research volume 1, pages 918–932 (2022)Citer cet article

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Le système squelettique des mammifères montre des différences sexuelles dans la structure, les fonctions, le vieillissement et l'incidence des maladies. Le rôle des vaisseaux sanguins dans les fonctions osseuses physiologiques, régénératives et pathologiques indique les conditions nécessaires à la compréhension de leur spécificité sexuelle. Dans cette étude, nous avons découvert que l'œstrogène régule la physiologie des vaisseaux sanguins pendant la grossesse et la ménopause par le biais du récepteur alpha des œstrogènes (ERα) et du récepteur 1 des œstrogènes couplés aux protéines G (GPER1), mais pas de la signalisation dépendante de l'ERβ chez la souris. L'œstrogène régule l'utilisation des lipides des cellules endothéliales osseuses (BEC) et favorise la lipolyse des adipocytes et l'absorption des acides gras (FA) du microenvironnement. Des conditions de faible taux d'œstrogènes faussent le métabolisme endothélial des AG pour accumuler des peroxydes lipidiques (LPO), entraînant un vieillissement vasculaire. Des niveaux élevés d'ions ferreux dans les BEC femelles intensifient l'accumulation de LPO et accélèrent le processus de vieillissement. Notamment, l'inhibition de la génération de LPO à l'aide de liproxstatine-1 chez des souris âgées a considérablement amélioré la santé osseuse. Ainsi, nos résultats démontrent les effets des œstrogènes sur les BEC et suggèrent que le ciblage de la LPO pourrait être une stratégie efficace pour gérer la santé du sang et des os chez les femmes.

Les modifications du système squelettique pendant la puberté, la grossesse et la ménopause sont contrôlées par les hormones sexuelles qui régulent directement ou indirectement le remodelage osseux physiologique et pathologique1,2. Le rôle des hormones sexuelles sur les cellules mésenchymateuses et les cellules hématopoïétiques est bien reconnu3,4. Bien qu'ils jouent un rôle central dans la physiologie du squelette en régulant le développement, la réparation, le vieillissement et la maladie5,6,7, la mesure dans laquelle les fonctions des vaisseaux sanguins diffèrent entre les sexes reste mal comprise. Dans cette étude, nous avons étudié les modifications des vaisseaux sanguins pendant la grossesse et la ménopause ainsi que le rôle des hormones stéroïdes dans la médiation de la croissance et du vieillissement des BEC.

Pour comprendre les changements cellulaires dans le microenvironnement osseux maternel (BM) pendant la grossesse, nous avons analysé le tibia de souris gravides à différents jours post-coïtum (dpc) en utilisant des méthodes d'imagerie améliorées8. Nous avons utilisé l'endomucine (Emcn) et le CD31 pour étiqueter les vaisseaux sanguins, l'osterix pour marquer les cellules de la lignée précoce des ostéoblastes (OBL) et la périlipine pour identifier les adipocytes dans le BM. Les capillaires de type H exprimant CD31high/Emcnhigh sont des vaisseaux sanguins angiogéniques qui soutiennent l'ostéogenèse dans l'os9,10. Nous avons observé une augmentation notable des vaisseaux de type H et des cellules OBL et une diminution des adipocytes dans les os des mères enceintes de 10, 5 dpc par rapport aux vierges, aux mâles et aux autres stades de grossesse (Fig. 1a et Extended Data Fig. 1a, b). L'augmentation du pourcentage de cellules endothéliales (CE) CD31 + CD45 − Ter119 − totales, de CD31high / Emcnhigh (type-H) au sein des CE totales et des CE proliférantes (Ki-67 +) a confirmé la promotion de l'angiogenèse à 10, 5 dpc (Fig. 1b, Données étendues Fig. 1c et Fig. 1 supplémentaire).

a, images confocales représentatives des changements de vaisseaux de type H (Emcnhigh/CD31high) dans les os maternels à différents moments de la grossesse de la souris et après l'accouchement. Les délais de grossesse sont représentés en jours post-coïtum (dpc) et en jours post-accouchement en jours post-partum (dpp). Barres d'échelle, 40 μm. b, Quantification des vaisseaux de type H décrits en a, en tant que surface des CE de type H normalisée à la surface de la métaphyse (mp) (n = 5) ; les CE totales (CD31+CD45−Ter119−) et les CE de type H (CD31high/Emcnhigh) sont caractérisées par cytométrie en flux (n = 5). Les données sont moyennes ± sd pour la quantification d'image et moyenne ± sem pour les données de cytométrie en flux ; ANOVA unidirectionnelle avec le test de Tukey. c, images confocales représentatives du véhicule et des souris modèles VCD (n = 5) (âgées de 20 semaines) représentant des vaisseaux de type H réduits dans le modèle VCD. Barres d'échelle, 40 μm. Les graphiques indiquent la zone des EC de type H normalisée à la zone des mp et des EC totales quantifiées par cytométrie en flux. Les données sont moyennes ± sd pour la quantification d'image et moyenne ± sem pour les données de cytométrie en flux ; test t bilatéral non apparié. d, Images confocales représentatives montrant des changements dans les vaisseaux de type H chez les souris mâles et femelles (P28) lors de traitements hormonaux avec quantification des CE de type H et quantification de la zone (n = 5) ; cytométrie en flux (véhicule n = 5 F, n = 7 M ; E2 n = 8 F, n = 7 M ; P4 n = 5 F, n = 5 M ; DHT n = 5 F, n = 5 M). Les données sont moyennes ± sd pour la quantification d'image et moyenne ± sem pour les données de cytométrie en flux ; ANOVA bidirectionnelle avec le test de Tukey. Barres d'échelle, 40 μm. F, femme ; M, mâle.

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Pour comprendre les changements cellulaires des BM pendant la ménopause, nous avons généré un modèle murin de ménopause en injectant du diépoxyde de vinylcyclohexène (VCD) chez des femelles de 12 semaines. L'injection de VCD pendant 20 jours et l'analyse après 32 jours ont confirmé l'épuisement complet des follicules ovariens (Fig. 2 supplémentaire), qui a modélisé les conditions de la ménopause humaine11,12. Les os de souris ménopausées présentaient une diminution des BEC totaux et de type H (Fig. 1c), en plus d'une réduction des cellules OBL et d'une augmentation des adipocytes (Extended Data Fig. 1d). Ces résultats montrent que la grossesse et la ménopause ont déclenché des changements significatifs dans les compartiments endothéliaux et mésenchymateux du BM.

Pour comprendre la contribution des hormones sexuelles dans ces changements cellulaires, nous avons administré les hormones sexuelles estradiol (E2 ; 17β-estradiol, 2 µg par jour), progestérone (P4 ; 1 µg par jour) et dihydrotestostérone (DHT ; 100 µg par jour) à de jeunes souris mâles et femelles pendant 10 jours et ont analysé leurs BM après 2 semaines. Le traitement systémique avec E2 a entraîné l'accumulation de capillaires de type H dans le compartiment de la moelle osseuse. Nous avons observé une fréquence plus élevée de CE totales et de type H dans les os des deux sexes par rapport aux os administrés par P4 et DHT (Fig. 1d et Extended Data Fig. 1e). L'augmentation des cellules OBL et le déclin des adipocytes des os traités à l'E2 ont indiqué que les changements cellulaires étaient similaires aux changements associés à la grossesse. Bien que les cellules OBL aient montré une augmentation marginale du traitement DHT, les adipocytes n'ont pas été modifiés dans les traitements P4 et DHT (Extended Data Fig. 2a). En plus des capillaires de type H, E2 a favorisé les vaisseaux artériolaires (vaisseaux CD31 + Emcn−) et transcorticaux (TCV) dans les os traités à l'E2. Les sous-types capillaires n'ont pas été modifiés dans les traitements P4 et DHT (données étendues Fig. 2b). L'analyse de la prolifération des EC à l'aide du marquage à la 5-éthynyl-2′-désoxyuridine (EdU) et de l'immunocoloration Ki-67 a montré une incorporation accrue d'EdU et la fréquence des EC Ki-67+ dans les os traités à l'E2. De même, les BEC primaires cultivées ont montré une prolifération accrue in vitro lors du traitement E2 (10 μM) (données étendues Fig. 2c, d). Nous avons également analysé les niveaux de transcription des facteurs angiogéniques dans les BEC purifiés pour comprendre l'angiogenèse. Une expression plus élevée de régulateurs angiogéniques connus dans les BEC traités à l'E2 par rapport aux témoins véhicules a soutenu la promotion de l'angiogenèse dans les os par des niveaux élevés d'E2 (données étendues Fig. 2e). La quantification des niveaux d'E2 à différents stades de la grossesse (données étendues Fig. 3a) a confirmé des niveaux élevés d'œstrogènes endogènes chez les mères enceintes de 10,5 dpc correspondant au statut de l'angiogenèse dans leurs os. De même, le vieillissement a réduit les niveaux d'E2 circulants chez la souris (Extended Data Fig. 3b). Pour étudier les modifications des vaisseaux sanguins dans les os dans des conditions systémiques de faible E2, nous avons utilisé des modèles de souris ovariectomisées (OVX). L'ovariectomie est une méthode établie pour réduire les taux d'E2 circulants et favoriser la perte osseuse13. Une ovariectomie a été réalisée chez des souris femelles âgées de 8 semaines et les os ont été analysés après 6 semaines. Les souris OVX ont démontré des phénotypes vasculaires et mésenchymateux similaires à l'épuisement du follicule ovarien. La récupération des phénotypes osseux chez les souris OVX lors de l'administration d'E2 a établi le rôle central de l'œstrogène dans ce phénotype (Extended Data Fig. 3c). Nous avons également utilisé le létrozole, un inhibiteur pharmacologique de l'aromatase, pour arrêter la synthèse des œstrogènes et, par conséquent, réduire les taux d'E2 circulants. L'administration de létrozole (100 µg par jour) chez la souris a réduit les capillaires angiogéniques de type H et les cellules OBL et a augmenté les adipocytes dans les os en développement (données étendues Fig. 3d). Ces découvertes ont établi le rôle des œstrogènes dans la régulation de la croissance des vaisseaux sanguins dans l'os.

Pour étudier les changements spécifiques endothéliaux médiés par les œstrogènes, nous avons étudié la signalisation ER dans les BEC. L'analyse des transcriptions des RE dans les BEC fraîchement isolés a montré l'expression de Esr1 (ERα), Esr2 (ERβ) et Gper1 (GPER1) chez les deux sexes (données étendues Fig. 4a). Nous avons étudié les fonctions des RE dans la croissance des vaisseaux sanguins en ciblant des récepteurs individuels dans les BEC. Nous avons généré des souris à perte de fonction inductibles spécifiques à la CE à l'aide d'allèles Esr1 (Esr1lox/lox)14, Esr2 (Esr2lox/lox)15 ou Gper1(Gper1lox/lox)16 flanqués de loxP avec la lignée de souris Cdh5(PAC)-CreERT217. Nous avons analysé les os masculins et féminins postnatals (âgés de 4 semaines) pour comprendre les modifications des vaisseaux sanguins. Les suppressions de gènes ont été confirmées par la quantification des niveaux de transcription du récepteur dans les BEC purifiés de souris témoins et mutantes (données étendues, Fig. 4b). La suppression d'un récepteur a montré une influence minimale sur les niveaux de transcription des autres récepteurs dans les BEC (données étendues Fig. 4b). La perte de fonctions spécifiques à la CE d'Esr1 et de Gper1 a entraîné la réduction des CE totales et de type H, alors que les mutants Esr2 ne manifestaient pas de phénotype endothélial chez les deux sexes (Fig. 2). Ainsi, l'inhibition des ER Esr1 et Gper1 a altéré la croissance des vaisseaux sanguins dans les os. Nous avons également observé une réduction du nombre d'OBL et une augmentation des adipocytes chez les mutants Esr1 et Gper1 (Extended Data Fig. 4c). Nous avons effectué une analyse par tomodensitométrie (micro-CT) des os mutants Esr1 et Gper1 pour comprendre les changements au niveau de l'ensemble de l'organe. Les données micro-CT ont confirmé la réduction de l'os trabéculaire et l'augmentation de la teneur en lipides des deux mutants endothéliaux (données étendues Fig. 5a, b). Une analyse plus approfondie a montré une épaisseur et une surface d'os cortical inchangées chez ces mutants endothéliaux. De même, les ostéoclastes sur les surfaces osseuses n'ont pas été modifiés par la suppression des RE sur les CE. Les ostéoclastes associés aux vaisseaux, un sous-type d'ostéoclastes présents à l'interface ostéochondrale, dépendent des vaisseaux sanguins angiogéniques18. La réduction des ostéoclastes associés aux vaisseaux dans la métaphyse a soutenu la croissance défectueuse des vaisseaux sanguins chez ces mutants (données étendues Fig. 5a, b). Ces résultats ont démontré le rôle fonctionnel de la signalisation ER dans les BEC et les modifications du BM.

Images confocales représentatives des changements de vaisseaux de type H (Emcnhigh/CD31high) lors de la suppression spécifique endothéliale des RE (Esr1, Esr2 et Gper1) à P28 chez la souris. Les graphiques indiquent les quantifications des CE totales (CD31+CD45−Ter119−) par cytométrie en flux pour Esr1 (contrôle n = 11 F, n = 7 M ; mutant n = 9 F, n = 6 M), Esr2 (contrôle n = 4 F , n = 4 M ; mutant n = 6 F, n = 5 M), Gper1 (témoin n = 6 F, n = 8 M ; mutant n = 6 F, n = 7 M) ; quantification du volume des vaisseaux de type H par champ de mp pour Esr1 (contrôle n = 11 F, n = 7 M ; mutant n = 9 F, n = 6 M), Esr2 (contrôle n = 4 F, n = 4 M ; mutant n = 6 F, n = 5 M), Gper1 (témoin n = 6 F, n = 8 M ; mutant n = 7 F, n = 10 M) ; et quantification de la zone EC de type H normalisée à la zone mp pour Esr1 (contrôle n = 11 F, n = 7 M ; mutant n = 9 F, n = 6 M), Esr2 (contrôle n = 4 F, n = 4 M ; mutant n = 6 F, n = 5 M), Gper1 (témoin n = 6 F, n = 6 M ; mutant n = 6 F, n = 9 M). Les données sont moyennes ± sd pour la quantification d'image et moyenne ± sem pour les données de cytométrie en flux ; ANOVA bidirectionnelle avec le test de Tukey. Barres d'échelle, 40 μm. F, femme ; M, homme ; mp, métaphyse.

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Les changements médiés par les œstrogènes dans le BM et les phénotypes mutants ER endothéliaux similaires chez les souris femelles et mâles nous ont intrigués pour étudier les différences de sexe dans les BEC. Nous avons effectué une analyse de séquençage d'ARN (ARN-seq) pour les BEC purifiés de souris femelles et mâles âgées de 2, 12 et 65 semaines afin de comprendre leurs différences sexuelles. L'analyse de l'expression génique à différents stades de croissance et de vieillissement fournirait des changements liés à l'âge dans les différences sexuelles endothéliales. L'analyse en composantes principales (ACP) a séparé les CE masculins et féminins en deux groupes, indiquant une variation entre les sexes à tous les groupes d'âge (Fig. 3a et ensemble de données supplémentaire 1). Les différences entre les sexes dans les transcriptomes BEC augmentaient avec l'âge, avec 48 gènes exprimés de manière différentielle (DE) chez les souris âgées de 2 semaines, contre 212 et 926 chez les souris âgées de 12 et 65 semaines, respectivement, à un niveau de signification Padj < 0,01 ( figure 3b). Nous avons observé un chevauchement étonnamment faible des gènes DE entre les groupes d'âge, avec le chevauchement le plus élevé de 72 gènes détecté entre les souris adultes et âgées (Fig. 3c et Extended Data Fig. 6a). Pour comprendre l'importance des données d'expression génique, nous avons effectué un enrichissement de l'ensemble de gènes généralement applicable (GAGE) pour l'analyse de la voie des gènes DE des données de 65 semaines19. Un total de quatre ensembles de gènes ont affiché des niveaux significatifs de différences avec un enrichissement évident de l'ensemble de gènes des voies métaboliques (Fig. 3d). L'analyse des gènes DE (Padj <0, 05) dans cet ensemble de gènes des voies métaboliques a montré un total de 142 gènes modifiés entre les BEC mâles et femelles, 43 gènes étant associés au métabolisme des FA (données étendues Fig. 6b et jeu de données supplémentaire 1). Cependant, la compréhension du métabolisme des BEC et de leur rôle dans l'angiogenèse est limitée.

a, tracés PCA des données ARN-seq montrant le regroupement par sexe dans les BEC de souris âgées de 2, 12 et 65 semaines (n = 3). b, les parcelles Volcano montrent le nombre de gènes DE significatifs corrigés par FDR (Bonferroni) valeur P (Padj <0, 01) par rapport au changement de pli log2 entre les CE osseuses femelles et mâles de souris âgées de 2, 12 et 65 semaines. Les gènes DE ont été obtenus en ajustant chaque gène à un modèle linéaire généralisé, suivi d'un test d'hypothèse à l'aide du test de Wald. c, diagramme de Venn montrant le chevauchement des gènes DE entre les CE osseuses mâles et femelles de souris âgées de 2, 12 et 65 semaines. d, GAGE ​​pour l'analyse des voies des gènes DE dans les données ARN-seq montrant les processus biologiques qui diffèrent entre les BEC masculins et féminins âgés. Les ensembles de données génétiques des voies métaboliques, du cycle cellulaire et de l'ADN sont régulés à la hausse, et les gènes de la voie de l'immunodéficience primaire sont régulés à la baisse. La signification de l'enrichissement a été calculée à l'aide de tests t à deux échantillons, et les termes KEGG significatifs ont été sélectionnés en utilisant P < 0,05. e, Graphique montrant la quantification des BEC cultivées en Ki-67+ dans le milieu sans nutriments additionné de glucose, de glutamine ou d'AF, avec véhicule (témoin n = 9, glucose n = 11, glutamine n = 15, AF n = 12) et traitement E2 (témoin n = 11, glucose n = 11, glutamine n = 13, AG n = 12). Les données sont moyennes ± sd ; ANOVA bidirectionnelle avec le test de Tukey. f, graphique montrant la quantification des BEC cultivés en Ki-67 + traités avec le véhicule ou l'E2, avec ou sans traitement à l'étomoxir (n = 5). Les données sont moyennes ± sd ; ANOVA bidirectionnelle avec le test de Tukey. g, images confocales représentatives de vaisseaux de type H (Emcnhigh/CD31high) chez des souris traitées avec un véhicule et traitées à l'étomoxir ; quantification des CE de type H normalisées à la surface de la métaphyse (mp) (n = 5). Les données sont moyennes ± sd ; test t bilatéral non apparié. CE totales (CD31+CD45−Ter119−) quantifiées par cytométrie en flux (n = 5). Les données sont moyennes ± sem ; test t bilatéral non apparié. Barres d'échelle, 50 μm. PC, composant principal.

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Pour comprendre la régulation métabolique basale des BEC, nous avons testé les principales voies métaboliques connues pour réguler l'angiogenèse dans d'autres systèmes20,21,22. Nous avons vérifié les suppléments nutritifs qui pourraient soutenir les BEC cultivés en l'absence d'AF (sans sérum), de glucose et de glutamine. Nous avons constaté que la supplémentation en BEC primaires avec des AG, mais pas en glucose ou en glutamine, a soutenu les BEC in vitro (Fig. 3e). Le résultat nous a incités à étudier plus avant et à inhiber le métabolisme des FA dans les BEC. CPT1A, carnitine palmitoyltransférase 1a, est une enzyme limitant la vitesse d'oxydation des FA en transportant les FA dans les mitochondries. Le traitement avec l'étomoxir, inhibiteur de CPT1A, a réduit la croissance des BEC en culture (Fig. 3f). De même, l'administration d'étomoxir chez des souris postnatales au jour 10 (P10) pendant 10 jours a réduit la croissance des vaisseaux sanguins dans les os (Fig. 3g). Pour étudier le rôle spécifique de l'endothélium osseux du métabolisme des FA, nous avons génétiquement ciblé CPT1A dans les EC en utilisant des souris Cpt1a floxées21 élevées avec Cdh5(PAC)CreERT2 spécifique à l'EC. La perte de la fonction CPT1A dans les BEC a montré une réduction de l'oxydation du palmitate 3H radiomarqué, indiquant une altération du métabolisme des FA (Fig. 4a). L'analyse des vaisseaux sanguins a montré une réduction des CE totales et de type H des os Cpt1aiΔEC par rapport à leurs témoins de même portée, indiquant une croissance défectueuse des vaisseaux sanguins (Fig. 4a). De plus, les os mutants Cpt1aiΔEC ont montré une réduction des cellules OBL et une augmentation des adipocytes. L'analyse micro-CT des os mutants a confirmé les modifications du contenu osseux et lipidique (données étendues Fig. 6c), suggérant l'importance du métabolisme endothélial des AG dans la régulation de la BM.

a, graphique montrant l'oxydation du palmitate marqué au 3H par des BEC témoins et supprimés par Cpt1a. Le graphique montre les niveaux d'ARNm Cpt1a dans les BEC purifiés à partir d'os mutants Cpt1a iΔEC. Images confocales représentatives de vaisseaux de type H (Emcnhigh/CD31high) chez des mutants de délétion Cpt1a témoins et endothéliaux, avec quantification du volume des vaisseaux sanguins de type H (contrôle n = 6 F, n = 8 M ; mutant n = 6 F, n = 5 M) et CE totales (CD31+CD45-Ter119-) caractérisées par cytométrie en flux (témoin n = 6 F, n = 5 M ; mutant n = 10 F, n = 5 M). Les données sont moyennes ± sd pour la quantification d'image (volume de type H) et moyennes ± sem pour les données de 3H-palmitate, de cytométrie en flux et de qPCR ; ANOVA bidirectionnelle avec le test de Tukey effectué à l'exception des données de 3H-palmitate (test t bilatéral non apparié). Barres d'échelle, 40 μm. b, Graphiques montrant l'oxydation du glucose (véhicule n = 6, E2 n = 5), de la glutamine (véhicule n = 5, E2 n = 5) et du palmitate (véhicule n = 6, E2 n = 6) dans le véhicule traité et E2- BEC traités, mesurés par radioactivité (désintégrations par minute (dpm)). Les données sont moyennes ± sem ; test t bilatéral non apparié. c, Graphique montrant l'oxydation du palmitate par les BEC traités avec le véhicule ou E2, avec ou sans traitement à l'étomoxir (n = 5). Les données sont moyennes ± sem ; ANOVA bidirectionnelle avec le test de Tukey. d, images confocales représentatives représentant des vaisseaux de type H (Emcnhigh/CD31high) chez des souris mutantes témoins et Cpt1aiΔEC traitées avec E2. Barres d'échelle, 50 μm. Les quantifications montrent des CE de type H normalisées à la zone de mp (contrôle n = 5 F, n = 5 M ; mutant n = 5 F, n = 5 M) et des CE totales (CD31+CD45−Ter119−) quantifiées par cytométrie en flux (témoin n = 5 F, n = 5 M ; mutant n = 5 F, n = 5 M). Les données sont moyennes ± sd pour la quantification d'image et moyenne ± sem pour les données de cytométrie en flux ; ANOVA bidirectionnelle avec le test de Tukey. F, femme ; M, homme ; mp, métaphyse.

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Nous avons ensuite étudié comment les œstrogènes influençaient le métabolisme endothélial en traitant les BEC primaires avec E2. E2 n'a pas modifié la dépendance aux FA des BEC dans des conditions d'appauvrissement en nutriments (Fig. 3e). En outre, une oxydation accrue du 3H-palmitate par rapport à l'oxydation inchangée du 14C-glucose ou de la 14C-glutamine a suggéré que le traitement à l'E2 favorisait l'utilisation des AG (Fig. 4b). Notamment, l'étomoxir a inhibé la prolifération cellulaire médiée par E2 (Fig. 3f) et l'oxydation des FA (Fig. 4c). Pour comprendre la relation in vivo, nous avons administré E2 à des souris mutantes Cpt1aiΔEC pour étudier l'angiogenèse. L'administration d'E2 n'a pas récupéré l'angiogenèse inhibée dans les os mutants Cpt1aiΔEC, soutenant la dépendance FA en aval de la croissance des vaisseaux sanguins médiée par E2 (Fig. 4d), tandis que E2 a augmenté les cellules OBL et réduit les adipocytes dans le compartiment mésenchymateux (Extended Data Fig. 6d) . Ensemble, les données ont indiqué que les œstrogènes nécessitaient des AG pour entraîner l'angiogenèse dans les os.

Il a été suggéré que les adipocytes de la moelle osseuse libèrent des AG libres comme source d'énergie pour les cellules hématopoïétiques23. Nous avons identifié que les BEC exprimaient la protéine 4 de liaison aux acides gras (FABP4), un transporteur lipidique membranaire impliqué dans l'absorption, le transport et le métabolisme des FA (Fig. 5a). Les os traités à l'E2 ont montré une régulation à la hausse de l'expression de FABP4 dans leurs vaisseaux sanguins (Fig. 5b et Extended Data Fig. 7a), ce qui nous a amenés à étudier le transport des lipides dans les BEC. Pour analyser l'absorption des FA dans les BEC, nous avons fourni une courte impulsion de 30 minutes de FA synthétiques conjugués à BODIPY dans le milieu. La détection de niveaux élevés de BODIPY dans les BEC traités par E2 par rapport aux témoins a indiqué la promotion de l'absorption de FA par E2 (Fig. 5c et Extended Data Fig. 7b). Nous avons également vérifié les niveaux de FA dans les BEC après le traitement E2 à l'aide de LipidTOX. La détection de plus de BEC avec des niveaux élevés de lipides intracellulaires a soutenu l'absorption de lipides lors du traitement E2 (données étendues Fig. 7c). Pour comprendre le rôle fonctionnel de FABP4 dans l'absorption de FA, nous avons traité les BEC avec l'inhibiteur pharmacologique de FABP4 BMS-309403 en présence et en l'absence de E2. Des niveaux réduits de BODIPY dans les BEC traités avec BMS-309403 (Fig. 5c) ont indiqué l'implication de FABP4 dans l'absorption de FA médiée par E2. En outre, nous avons étudié l'absorption des lipides en présence de l'inhibiteur de signalisation ER G36, un antagoniste pharmacologique de GPER1. L'absorption altérée de BODIPY dans les BEC traités avec G36 a confirmé le transport des lipides en tant que mécanisme en aval de la signalisation ER (données étendues Fig. 7d). De plus, l'expression réduite de FABP4 dans les vaisseaux sanguins des souris mutantes Esr1iΔEC et Gper1iΔEC (données étendues Fig. 7e) a indiqué l'association entre une absorption défectueuse de FA et une angiogenèse réduite.

a, Projection d'intensité maximale de l'image confocale montrant le chevauchement de l'expression de FABP4 (vert) dans les EC osseux chevauchant l'expression d'Emcn (rouge). Barres d'échelle, 50 μm. b, les graphiques montrent la quantification des niveaux de protéine FABP4 observés dans des coupes de tissu osseux d'os traités par véhicule et traités par E2 (n = 5) imagés par microscopie confocale. Les données sont moyennes ± sd ; ANOVA bidirectionnelle avec le test de Tukey. Les niveaux de transcription ont été quantifiés à partir de CE osseuses isolées de souris ayant reçu un véhicule et ayant reçu de l'E2 (n = 5) à l'aide de la qPCR. Les données sont moyennes ± sem ; ANOVA bidirectionnelle avec le test de Tukey. c, Images confocales représentatives de l'absorption lipidique des FA synthétiques conjugués à BODIPY dans les BEC traités par véhicule et traités par E2 lors du traitement par l'inhibiteur FABP4 BMS-309403. Barres d'échelle, 15 μm. La quantification montre des unités de fluorescence réduites (FU, intensité) de la BODIPY endothéliale lors de l'inhibition de FABP4 sur plusieurs champs de vision ×63 (véhicule n = 37 ; véhicule + BMS-309403 n = 36 ; E2 n = 41 ; E2 + BMS-309403 n = 42). Les données sont moyennes ± sd ; ANOVA bidirectionnelle avec le test de Tukey. d, Images confocales représentatives d'adipocytes BM (périlipine +, vert) d'os jeunes et âgés. Barres d'échelle, 50 μm. Les graphiques montrent le nombre moyen d'adipocytes périlipine + (n = 17), la taille (n = 15) et la quantification de l'intensité de fluorescence, indiquant une diminution de l'enzyme lipolytique ATGL chez les souris âgées (n = 84 F, 52 M) par rapport aux jeunes souris (n = 50 F, 58 M) par cellule sur plusieurs champs de vision ×20. Les données sont moyennes ± sd ; ANOVA bidirectionnelle avec le test de Tukey. e, Images confocales représentatives d'adipocytes BM (périlipine +), avec quantification de l'intensité de fluorescence indiquant une diminution de l'enzyme lipolytique HSL chez les souris âgées (HSL n = 120 F, 168 M) par rapport aux souris P28 (HSL n = 78 F, 88 M ) par cellule sur plusieurs champs de vision ×20. Les données sont moyennes ± sd ; ANOVA bidirectionnelle avec le test de Tukey. Barres d'échelle, 50 μm. F, femme ; M, homme ; Plin, périlipine.

Données source

L'absorption de FA défectueuse et l'angiogenèse dans les BEC des os mutants Esr1iΔEC et Gper1iΔEC étaient associées à l'accumulation d'adipocytes dans le microenvironnement. Le déclin lié à l'âge de l'angiogenèse et de l'ostéogenèse6,7,9,24,25 impliquait une augmentation simultanée des adipocytes26,27. Le statut angiogénique réduit des os vieillissants est associé à une augmentation du nombre et de la taille des adipocytes dans le BM. Au contraire, les os jeunes avec une angiogenèse élevée présentaient des adipocytes plus petits et moins nombreux, indiquant une relation inverse entre les CE angiogéniques et les adipocytes (Fig. 5d, e). Les adipocytes plus petits présents dans les os jeunes ont montré une expression élevée des enzymes lipolytiques lipase triglycéride adipeuse (ATGL) et lipase hormono-sensible (HSL) par rapport aux adipocytes plus grands présents dans les os âgés. Ainsi, des adipocytes limités présents dans les os jeunes angiogéniques présentaient des niveaux élevés d'enzymes lipolytiques. De même, les os âgés présentant une angiogenèse réduite présentaient de faibles niveaux de lipases lipolytiques dans leurs adipocytes (Fig. 5d, e).

Il a déjà été démontré que les adipocytes expriment les ER et répondent aux niveaux d'œstrogènes circulants28,29. Cependant, la variation du nombre d'adipocytes chez les mutants endothéliaux (voir phénotypes adipocytaires des souris Esr1iΔEC, Gper1iΔEC et Cpt1aiΔEC) nous a incités à étudier l'expression des enzymes lipolytiques chez ces mutants. Les adipocytes présents dans les os mutants Cpt1aiΔEC et Gper1iΔEC présentaient de faibles niveaux de lipases lipolytiques (données étendues Fig. 8a). Les données ont indiqué l'implication des BEC dans la régulation de la lipolyse des adipocytes dans le BM. Pour identifier les signaux potentiels dérivés des EC agissant sur les adipocytes, des BEC isolés ont été analysés pour l'expression de facteurs lipolytiques. Les BEC purifiés de souris ayant reçu de l'E2 ont montré une régulation à la hausse de Tnfa et Il6, qui sont des facteurs lipolytiques paracrines bien reconnus. La signalisation ER altérée dans les BEC mutants Esr1iΔEC et Gper1iΔEC a montré une régulation à la baisse des niveaux endothéliaux de Tnfa et Il6 (données étendues Fig. 8b). L'expression réduite de ces facteurs lipolytiques a favorisé l'accumulation d'adipocytes dans ces os mutants. De même, le traitement E2 des BEC cultivés in vitro a libéré des niveaux plus élevés de TNF-α et d'IL-6 dans le milieu par rapport au traitement témoin (données étendues Fig. 8c), confirmant leur libération d'angiocrine par les BEC. Une diminution de l'angiogenèse et, par conséquent, de l'utilisation des lipides dans les BEC est associée à la réduction de la lipolyse et à l'accumulation d'adipocytes dans le BM. Ces données suggèrent une interaction métabolique entre l'angiogenèse et la lipolyse dans le BM.

Le vieillissement squelettique est associé à des changements dans les vaisseaux sanguins qui contribuent à la perte osseuse9,24,25. La baisse des taux d'œstrogène liée à l'âge30,31,32,33 a entraîné une grave perte osseuse chez les femmes. Il a été démontré que l'administration d'œstrogènes prévient la perte osseuse liée à l'âge34,35,36,37. L'administration d'E2 à des souris vieillissantes a favorisé les EC totaux, les capillaires de type H et les cellules OBL et a diminué les adipocytes (données étendues Fig. 9a). Nous avons également noté une augmentation des artérioles et des vaisseaux transcorticaux dans les os des souris ayant reçu de l'E2 (Extended Data Fig. 9b). L'augmentation associée à l'âge des espèces réactives de l'oxygène cellulaire (ROS)38 a été largement reconnue. Remarquablement, l'administration d'E2 chez des souris vieillissantes a considérablement réduit les niveaux de ROS endothéliales dans les vaisseaux sanguins (Fig. 6a). Une analyse plus approfondie a montré une accumulation de LPO dans les BEC vieillissants, comme en témoigne l'utilisation des niveaux de 4-hydroxynonenal39 (HNE) et de BODIPY 665/676, un capteur LPO. Nous avons trouvé des niveaux réduits de LPO dans les BEC de souris ayant reçu de l'E2 (Fig. 6b, c et Extended Data Fig. 9c). De même, une augmentation de la HNE endothéliale des os induits par la ménopause a plaidé en faveur de la peroxydation lipidique élevée dans des conditions d'épuisement des œstrogènes (données étendues Fig. 9d).

a, Parcelles représentatives de la cytométrie en flux de la génération de ROS dans les EC de souris traitées par le véhicule (n = 8 F, n = 8 M) et de souris traitées à l'E2 (n = 7 F, n = 7 M). Les pics rouges dans les tracés d'histogramme indiquent des cellules non colorées. Les quantifications montrent une réduction des ROS lors du traitement E2. Les données sont moyennes ± sem ; ANOVA bidirectionnelle avec le test de Tukey. b, Quantifications des niveaux de 4-HNE dans les CE à partir de l'immunocoloration chez les jeunes souris traitées avec le véhicule (n = 5 F, n = 5 M) et les souris traitées avec l'E2 (n = 5 F, n = 5 M) et les souris âgées traitées avec le véhicule souris (n = 5 F, n = 5 M) et souris traitées à l'E2 (n = 5 F, n = 5 M), montrant une réduction des taux de 4-HNE lors du traitement à l'E2. Les données sont moyennes ± sd ; ANOVA bidirectionnelle avec le test de Tukey. c, Parcelles représentatives de la cytométrie en flux de la génération de LPO dans les EC de jeunes souris traitées avec un véhicule (n = 5 F, n = 5 M) et de souris traitées avec E2 (n = 5 F, n = 5 M) et de souris âgées traitées avec un véhicule (n = 6 F, n = 5 M) et souris traitées à l'E2 (n = 5 F, n = 5 M). Les pics rouges dans les tracés d'histogramme indiquent des cellules non colorées. Les quantifications montrent une réduction de la LPO lors du traitement E2. Les données sont moyennes ± sem ; ANOVA bidirectionnelle avec le test de Tukey. d, graphique montrant les différences entre les sexes dans les concentrations d'ions ferreux intracellulaires dans les BEC de souris traitées par le véhicule et traitées par E2 (n = 4). Les données sont moyennes ± sem ; ANOVA bidirectionnelle avec le test de Tukey. e, Parcelles représentatives de cytométrie en flux avec des quantifications montrant des différences de sexe dans les ions ferreux intracellulaires dans les BEC chez les souris P10 (n = 6 F, n = 8 M) et les souris âgées (n = 6 F, n = 4 M). Les données sont moyennes ± sem ; test t bilatéral non apparié. f, Parcelles représentatives de cytométrie en flux avec des quantifications montrant une augmentation des EC de type H (CD31high/Emcnhigh) avec un traitement Lip-1 chez des souris âgées (véhicule n = 6 F, n = 5 M ; Lip-1 n = 5 F, n = 5M). Les données sont moyennes ± sem ; ANOVA bidirectionnelle avec le test de Tukey. g, Parcelles représentatives de cytométrie en flux de populations BEC de souris âgées traitées avec un véhicule et traitées avec Lip-1. Les quantifications sont des CE avec des ROS lipidiques (véhicule n = 6 F, n = 4 M; Lip-1 n = 4 F, n = 4 M), indiquant une réduction lors du traitement Lip-1. Les pics rouges dans les tracés d'histogramme indiquent des cellules non colorées. Les données sont moyennes ± sem ; ANOVA bidirectionnelle avec le test de Tukey. F, femme ; M, mâle.

Données source

Il a été démontré que FABP4 contribue à la protection contre le stress oxydatif en réduisant le ROS40 cellulaire. Notamment, l'administration d'E2 a amélioré l'expression de FABP4 dans l'endothélium osseux âgé et a indiqué une relation potentielle entre FABP4 et les LPO dans les BEC (Extended Data Fig. 10a). L'inhibition de FABP4 dans les BEC a montré une accumulation de HNE, suggérant son implication dans la génération de LPO (Extended Data Fig. 10b). La supplémentation en E2 n'a pas pu réduire l'accumulation de HNE médiée par FABP4, indiquant la dépendance de FABP4 de la fonction E2 (Extended Data Fig. 10b). De plus, les données ont plaidé pour l'étude de la fonction E2 dans la régulation de multiples mécanismes cellulaires qui entraînent la génération de peroxydes.

Les niveaux cellulaires de Fe2+ contribuent à la génération de LPO dans les cellules par un mécanisme dépendant de la ferroptose41,42. Pour comprendre la contribution de Fe2+ à l'augmentation liée à l'âge des niveaux de LPO endothéliale, nous avons étudié la concentration de Fe2+ dans les BEC masculins et féminins. La concentration intracellulaire labile de Fe 2 + était plus élevée dans les BEC mâles purifiés que chez les femelles et n'a pas été modifiée par le traitement à l'E2 dans les jeunes BEC (Fig. 6d). Nous avons ensuite utilisé le marquage FeRhoNox-1 pour détecter et quantifier les niveaux de Fe2+ dans les BEC. Le marquage FeRhoNox-1 a également détecté des niveaux élevés de Fe2+ chez les jeunes mâles BEC par rapport aux femelles. Fait intéressant, la quantification dans les os âgés a montré un pourcentage plus élevé de BEC Fe2 + chez les femmes vieillissantes par rapport aux hommes (Fig. 6e). La culture de BEC primaires avec du mésylate de déféroxamine (DFM), un chélateur du fer, a entraîné la réduction des niveaux de LPO endothéliale. En conséquence, l'induction de la production de peroxyde médiée par Fe2+ à l'aide d'artémisinine a augmenté les niveaux de LPO endothéliale. Le traitement à l'E2 a réduit les niveaux de LPO dans les BEC traités au DFM et à l'artémisinine in vitro (données étendues Fig. 10c). Il a été démontré que le DFM favorise les vaisseaux de type H et l'ostéogenèse chez les souris âgées9. Nous avons trouvé des niveaux réduits de LPO dans les BEC de souris ayant reçu du DFM (Extended Data Fig. 10d). De même, le traitement à l'artémisinine (200 mg kg -1) chez les jeunes souris a entraîné une réduction des capillaires de type H et des cellules OBL sans modification des adipocytes (Extended Data Fig. 10e). Ces données suggèrent le rôle de Fe2+ dans la production de LPO endothéliale et, par conséquent, le vieillissement du phénotype des vaisseaux sanguins dans l'os.

Des niveaux basaux élevés de Fe2+ chez les CE féminines âgées pourraient aggraver la production de LPO et la perte de type H et d'os dans des conditions d'épuisement des œstrogènes telles que la ménopause. La réduction de la production de LPO par E2 (Fig. 6b, c) a suggéré un mécanisme potentiel sous-jacent aux avantages cliniques du traitement hormonal substitutif (THS) pour la perte osseuse post-ménopausique. Pour tester cela, nous avons ciblé pharmacologiquement la production de LPO à l'aide de liproxstatine-1 (Lip-1), un inhibiteur de peroxyde lipidique, chez des souris âgées. Les souris âgées traitées avec le véhicule témoin contenaient peu de vaisseaux de type H par rapport aux souris ayant reçu Lip-1 (10 mg kg -1), ce qui a montré une augmentation des capillaires angiogéniques (Fig. 6f). L'analyse des niveaux de ROS dans les BEC a démontré une réduction des os traités par Lip-1 (Fig. 6g). De plus, l'augmentation des capillaires de type H médiée par Lip-1 est associée à l'augmentation des cellules OBL et à la réduction des adipocytes dans les os âgés (Fig. 7a). L'analyse micro-CT des os âgés a confirmé l'augmentation observée de l'os et la réduction de la teneur en lipides des souris traitées avec Lip-1 (Fig. 7b et Extended Data Fig. 10f).

a, Images confocales représentatives de BM chez des souris âgées traitées avec Lip-1, avec des graphiques montrant la quantification du volume des vaisseaux de type H par champ de mp (véhicule n = 5 F, n = 5 M ; Lip-1 n = 5 F, n = 5 M), cellules osterix+ par mm de mp (véhicule n = 5 F, n = 5 M ; Lip-1 n = 5 F, n = 5 M) et surface périlipine+ par mm de surface (véhicule n = 5 F, n = 5 M ; Lip-1 n = 5 F, n = 5 M). Les données sont moyennes ± sd ; ANOVA bidirectionnelle avec le test de Tukey. Barres d'échelle, 40 μm (véhicule) et 50 μm (Lip-1). b, Images micro-CT représentatives d'os de souris âgées traitées avec Lip-1, avec des graphiques montrant la quantification du volume, du nombre, de l'épaisseur et de la séparation de l'os trabéculaire (n = 4) et du volume des adipocytes (n = 4). Les données sont moyennes ± sem ; ANOVA bidirectionnelle avec le test de Tukey. F, femme ; M, homme ; Osx, ostérix ; Plin, périlipine.

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Dans cette étude, nous avons découvert que les œstrogènes jouent un rôle important dans la médiation de la croissance des vaisseaux sanguins en favorisant le métabolisme des AG dans les BEC (Fig. 8). Les études génétiques sur la perte de fonction des ER indiquent une signalisation œstrogénique constitutive dans le système vasculaire osseux des BEC masculins et féminins et plaident fortement pour l'étude de leur dose-dépendance, de leurs interactions et de leur redondance dans la médiation de la signalisation en aval.

L'œstrogène régule la croissance des vaisseaux sanguins dans les os par l'intermédiaire de l'ESR1 et du GPER1 endothéliaux. La signalisation ER régule l'utilisation par les EC du métabolisme des FA en favorisant la libération par l'angiocrine de facteurs lipolytiques, d'enzymes et d'absorption des FA à partir du microenvironnement. L'altération du métabolisme des lipides dans l'endothélium âgé et les différences sexuelles dans les niveaux d'ions ferreux endothéliaux stimulent le phénotype de vieillissement dans les vaisseaux sanguins des os.

L'angiogenèse dans les os en croissance active est liée à un nombre limité d'adipocytes, et le déclin de l'angiogenèse lié à l'âge est associé à l'accumulation d'adipocytes dans l'os. Chez les femmes, il a été identifié que le traitement aux œstrogènes provoque une lipolyse et réduit la teneur en lipides de la moelle osseuse43. Le rôle des œstrogènes dans la régulation des adipocytes osseux est largement reconnu. Ici, nous montrons une association jusque-là inconnue entre les vaisseaux sanguins et les adipocytes. Nous avons constaté que l'inhibition du métabolisme des lipides dans les BEC entraînait une augmentation des adipocytes dans le BM. Dans les modèles animaux ménopausiques, la réduction de l'angiogenèse est associée à l'accumulation d'adipocytes, similaire au vieillissement chez l'homme. Nos données suggèrent que l'œstrogène pourrait réguler le couplage métabolique pour maintenir l'équilibre énergétique dans le BM en entraînant la lipolyse pour la croissance des vaisseaux sanguins.

La nature spécifique des tissus du vieillissement vasculaire44 en est encore aux premiers stades de la compréhension. Nous avons constaté que les niveaux d'ions ferreux intrinsèques pouvaient accélérer le vieillissement des BEC et contribuer à la perte osseuse observée chez les femmes vieillissantes par rapport aux hommes. La nature dépendante du fer et non hémique des lipoxygénases corrobore l'importance du fer dans les taux de LPO endothéliale. Dans l'ensemble, l'œstrogène est un facteur clé qui limite l'accumulation de LPO dans les BEC. Les effets combinés de la réduction des œstrogènes, des ions ferreux et des LPO contribuent au vieillissement accéléré chez les femmes. Cette étude soutient la notion fondamentale d'enquêter sur les différences sexuelles dans le système vasculaire pour comprendre les préjugés sexistes observés dans l'incidence des maladies cardiovasculaires liées à l'âge. Les résultats de cette étude identifient les LPO comme une cible en aval des œstrogènes et suggèrent que le ciblage des LPO pourrait être une stratégie alternative au THS pour traiter la perte osseuse post-ménopausique et la réparation osseuse. De plus, la connaissance fondamentale des différences sexuelles endothéliales osseuses peut être bénéfique pour développer une médecine de précision contre les maladies du sang et des os.

Toutes les expérimentations animales ont été menées conformément aux directives et aux lois institutionnelles, en suivant les protocoles approuvés par l'Imperial College London Animal Welfare and Ethical Review Body et le Home Office UK. Toutes les expériences de type sauvage ont été réalisées sur des souris C57BL/6J et étaient appariées selon l'âge et le sexe. Toutes les souris transgéniques ont été appariées selon l'âge et le sexe pour chaque expérience.

Pour les expériences de grossesse, le début de la grossesse a été déterminé par la présence d'un bouchon vaginal. Les souris ont été abattues les jours pertinents après l'identification du bouchon vaginal, ainsi que des femelles vierges et des souris mâles comme témoins.

Pour les traitements hormonaux, les souris ont reçu une injection sous-cutanée (sc) de 2 μg de 17β-estradiol (Acros Organics), 1 mg de progestérone (Acros Organics) ou 100 μg de DHT (TCI) dissous dans de l'éthanol et de l'huile de maïs (100 μl). Les souris véhicule ont reçu la dose équivalente d'éthanol dans l'huile de maïs. Les chiots (P10) ont reçu dix injections intermittentes et les souris âgées (65 à 75 semaines) ont reçu trois injections par semaine pendant 6 semaines. Les souris injectées avec du 17β-estradiol ont reçu une injection intrapéritonéale (ip) d'EdU (250 mg ml-1) 3 heures avant l'abattage pour identifier les EC en cours de prolifération. Les chiots (P10) ont reçu dix doses de 10 μg de létrozole (Sigma-Aldrich) dans du DMSO pour un traitement anti-aromatase.

Pour le modèle de ménopause murine, des souris femelles ont reçu une injection de 160 mg kg -1 jour -1 de 4-vinyl cyclohexène diépoxyde (Fluorochem) pendant 20 jours et laissées pendant 32 jours supplémentaires pour induire une atrésie folliculaire complète. Des échantillons vaginaux ont été prélevés quotidiennement pour confirmer la persistance du dioestrus. Les souris témoins ont reçu une injection de PBS.

Les souris OVX ont été achetées chez Charles River Laboratories UK. Une ovariectomie a été réalisée sur des souris de type sauvage C57BL/6J. Les cohortes E2 ont reçu du 17β-estradiol 2 semaines après la chirurgie pendant 4 semaines (trois injections par semaine), tandis que les cohortes témoins ont reçu des injections de véhicule.

Le DFM a été administré à 25 μg g-1 poids de souris ip pendant 2 semaines tous les deux jours. Les souris ont été sacrifiées le lendemain de la dernière injection pour analyse. Pour inhiber CPT1A, l'étomoxir à 30 mg kg-1 a été injecté par voie ip pendant 10 jours et les souris ont été sacrifiées sur P28.

Pour la suppression spécifique endothéliale des RE, des souris conditionnelles Esr1lox/lox, Esr2lox/lox ou Gper1lox/lox ont été accouplées avec des souris transgéniques Cdh5(PAC)-CreERT2. L'activité Cre a été induite par des injections de tamoxifène (80 mg kg-1) de souris P10–P14, et les souris ont été analysées à P28. Des souris Cre- de même portée ont également reçu une injection de tamoxifène et ont été utilisées comme témoins. De même, des souris Cpt1alox/lox conditionnelles ont été accouplées avec des souris transgéniques Cdh5(PAC)-CreERT2 pour une délétion spécifique endothéliale, et les souris ont été analysées à P28. Pour induire l'activité Cre au stade adulte, les souris ont été injectées de P66 à P70 et abattues sur P84.

Pour induire la génération de LPO chez les jeunes souris, les souriceaux (P10) ont reçu cinq injections ip intermittentes d'artémisinine (TCI, 200 mg kg-1) dans du DMSO. Des souris âgées ont reçu 15 doses de Lip-1 (Tocris Bioscience, 10 mg kg-1) ip pendant 4 semaines pour inhiber la production de LPO.

Les tibias ont été disséqués et nettoyés et ont subi une fixation immédiate pendant 4 heures sur de la glace dans une solution de paraformaldéhyde (PFA) à 4 %, suivie d'une décalcification avec de l'EDTA 0,5 M sous agitation constante à 4 °C. Les os ont ensuite été conservés dans une solution de cryoconservation (20 % (p/v) de saccharose et 2 % (p/v) de polyvinylpyrrolidine (PVP)) pendant encore 48 heures. Pour la cryosection, les os ont été inclus dans 8 % (p/v) de gélatine, 20 % (p/v) de saccharose et 2 % (p/v) de PVP. Un cryostat Leica a été utilisé pour générer des coupes de 70 μm sur des lames microscopiques utilisées pour l'immunocoloration.

Pour les analyses phénotypiques des tibias par immunohistochimie, des coupes osseuses ont été hydratées avec du PBS, suivies d'une perméabilisation avec 0,25% de Triton X-100 pendant 10 minutes et d'un blocage avec 5% de sérum d'âne (DS) pendant 30 minutes. L'anticorps primaire a été dilué dans du DS à 5 % et incubé pendant 2,5 heures à température ambiante ou pendant une nuit à 4 °C. Les anticorps primaires utilisés comprenaient l'anti-endomucine (Santa Cruz Biotechnology, 1:100), l'anti-osterix (Abcam, 1:600), l'anti-CD31 (R&D Systems, 1:100), l'anti-périlipine (Cell Signaling Technology, 1 : 100), anti-périlipine (GeneTex, 1:100), anti-Ki-67 (Abcam, 1:100), anti-laminine (Sigma-Aldrich, 1:100), anti-FABP4 (R&D Systems, 1:100 ), anti-4-hydroxynonenal (Abcam, 1:200), anti-HSL (Cell Signaling Technology, 1:50), anti-ATGL (Cell Signaling Technology, 1:100), anti-CD45 (BD Pharmingen, 1 : 100) et anti-Itgb3 (Cell Signaling Technology, 1:100).

Les lames ont ensuite été lavées trois fois avec du PBS pendant 5 minutes chacune et incubées avec un anticorps secondaire conjugué à un fluorophore dilué dans du DS à 5 % pendant 1 heure à température ambiante. Les anticorps secondaires utilisés comprenaient l'Alexa Fluor 594 anti-rat (Invitrogen, A21209, 1:400), l'Alexa Fluor 488 anti-rat (Invitrogen, A21208, 1:400), l'Alexa Fluor 488 anti-chèvre (Invitrogen, A11055, 1:400 ), anti-chèvre Alexa Fluor 546 (Invitrogen, A11056, 1:400), anti-chèvre Alexa Fluor 647 (Invitrogen, A21447; 1:400), anti-lapin Alexa Fluor 488 (Invitrogen, A21206, 1:400), anti-lapin Alexa Fluor 546 (Invitrogen, A10040, 1:400) et DAPI pour la coloration nucléaire. Les lames ont été lavées trois fois avec du PBS pendant 10 minutes chacune, puis montées avec une lamelle en utilisant la solution Fluoromount G (Southern Biotech).

Le marquage EdU a été effectué par la chimie Click-iT (Invitrogen, C10340) conformément aux directives du fabricant, après des incubations d'anticorps primaires et secondaires.

Des images tridimensionnelles (3D) haute résolution ont été acquises à l'aide d'un microscope confocal à balayage laser Leica TCS SP8 utilisant le logiciel Leica LASX.

Nous avons recueilli des tibias et des fémurs frais de mutants et de leurs témoins de même portée ou de souris témoins et traitées pour une analyse phénotypique à l'aide de micro-CT. Les os fraîchement isolés ont été soigneusement nettoyés et fixés dans du PFA à 4 %. Pour analyser les régions minéralisées dans les os, des os fixes ont été utilisés pour la micro-CT. Pour l'analyse des lipides, nous avons effectué un marquage au tétroxyde d'osmium. En bref, les os fixés ont été décalcifiés dans une solution d'EDTA pendant 3 à 10 jours et colorés avec une solution de tétroxyde d'osmium à 2 % pendant 48 heures. Les os ont ensuite été soigneusement lavés et stockés jusqu'à l'analyse. Les os ont été scannés à l'aide d'un micro-CT à faisceau conique (μCT 100, Scanco Medical) et du logiciel IPL version 5.15 de Scanco Medical. Une taille de voxel de 10 μm a été choisie dans les trois dimensions spatiales. Pour chaque échantillon, au moins 400 tranches ont été évaluées, couvrant plus de 4 mm à une tension de 70 kVp, une intensité de 114 μA, 8 W et un temps d'intégration de 800 ms. Pour l'évaluation, une longueur de 3 mm sous la plaque de croissance a été choisie comme volume d'intérêt.

Les tibias et les fémurs ont été disséqués et collectés dans du PBS glacé et lavés ensuite avec du PBS stérile dans des conditions stériles. Les os ont été broyés avec un mortier et un pilon, et les débris osseux restants ont été digérés avec de la collagénase pendant 20 minutes à 37 ° C et filtrés ensemble pour obtenir une suspension unicellulaire. Une lyse des globules rouges (RBC) (ChemCruz) a été effectuée (5 minutes, température ambiante) pour éliminer les globules rouges, puis les cellules totales ont été culottées et conservées sur de la glace.

Les BEC ont été isolées à l'aide de Dynabeads mouton anti-rat IgG (Invitrogen) en suivant le protocole du fabricant. En bref, les billes ont d'abord été recouvertes d'endomucine de rat (Santa Cruz Biotechnology) pendant 45 minutes sur un rotateur à 4 ° C, lavées avec un tampon d'isolement (0, 1% FBS-PBS) sur un support magnétique, puis incubées avec des cellules totales pendant 30 minutes sur un rotateur à 4 ° C pour isoler les CE uniquement. Le mélange a été lavé avec un tampon d'isolement sur un support magnétique pour isoler une sélection positive de cellules exprimant l'endomucine et étalé dans des plaques de culture cellulaire revêtues de fibronectine (Sigma-Aldrich) dans un milieu de base EBM-2 (Lonza) complété par une croissance EGM-2. milieu (2 % FBS, 0,4 % hFGF-B, 0,1 % VEGF, 0,1 % R3-IGF-1, 0,1 % acide ascorbique, 0,1 % hEGF, 0,1 % héparine et 0,04 % hydrocortisone). Les cellules ont été passées tous les 3 à 4 jours en utilisant 0, 25% de trypsine-EDTA (Sigma-Aldrich).

Des BEC cultivées dans du milieu complet EGM2 pendant 1 jour ont été utilisées pour cette expérience. Après lavage au HBSS, les cellules ont été traitées soit avec du véhicule (DMSO) soit avec du 17β-estradiol (10 μM) pendant 16 heures dans du milieu EC sans glucose, sans glutamine et sans sérum (Cell Biologics) et additionné de 5 mM de glucose , glutamine 2 mM ou acide linoléique-acide oléique 20 mM (Sigma-Aldrich) pour déterminer l'effet de la supplémentation en nutriments sur la croissance cellulaire. Les cellules ont été colorées avec un anticorps anti-Ki-67 (Abcam, 1:300) pour mesurer la prolifération des CE ou avec un anticorps anti-caspase-3 clivée (Cell Signaling Technology, 1:300) pour mesurer l'apoptose.

Les BEC cultivées sur des lamelles ont été traitées avec du véhicule (DMSO) ou du 17β-estradiol pendant 60 heures, puis incubées avec BODIPY 558/568 C12 (Thermo Fisher Scientific, 1 μM) ou colorées avec du HCS LipidTOX Green (Thermo Fisher Scientific, 1:1 000 ) pendant 30 minutes à 37 °C. Les cellules ont été lavées et montées sur des lames et imagées à l'aide d'un microscope confocal Leica TCS SP8.

Les BEC cultivées sur des lamelles ont été traitées avec du véhicule (DMSO) ou du 17β-estradiol avec de l'étomoxir (100 μM). Les cellules ont été colorées avec un anticorps anti-Ki-67 (Abcam, 1:300) pour mesurer la prolifération des CE ou avec un anticorps anti-caspase-3 clivée (Cell Signaling Technology, 1:300) pour mesurer l'apoptose.

Les BEC cultivées sur des lamelles ont été traitées avec du véhicule (DMSO) ou du 17β-estradiol avec du BMS-309403 (10 μM). Les cellules ont été colorées avec BODIPY 558/568 C12 pour déterminer si l'absorption de lipides était réduite.

Les BEC cultivées sur des lamelles ont été traitées avec un véhicule (DMSO) ou du 17β-estradiol avec du G36 (Tocris Bioscience, 10 μM) pendant 60 heures, puis colorées pour BODIPY 558/568 C12 comme expliqué pour l'absorption des lipides.

Les BEC ont été cultivés séparément à partir d'os masculins et féminins et traités avec du véhicule (DMSO) ou du 17β-estradiol pendant 60 heures avant le test. Les BEC ont été collectés par trypsinisation et centrifugation et lysés par sonication et remis en suspension dans un tampon de dosage du fer (Abcam, ab8366.) Le dosage a été effectué conformément aux directives du fabricant pour le dosage du fer (II) avec une densité optique (DO) mesurée à 593 nm et du fer. (II) teneur déterminée par une courbe standard.

Les LPO générés par les réactions d'oxydoréduction des ions ferreux ont été mesurés par un dosage colorimétrique (Cayman Chemical, 705003) suivant le protocole du fabricant. En bref, les EC totaux ont été isolés des os de souris jeunes et âgées traitées avec un véhicule ou E2 comme expliqué précédemment en utilisant des Dynabeads et lysées par sonication lors du retrait des billes. Une extraction méthanol: chloroforme a suivi, en prenant la couche de chloroforme pour réaction avec des ions thiocyanate pour détecter les LPO générés en mesurant la DO à 500 nm à l'aide du lecteur de microplaques FLUOstar Omega 3.0.

La concentration en 17β-estradiol a été déterminée à partir du sérum sanguin par un ELISA (Abcam, ab108667) selon le protocole du fabricant. Le sang circulant a été prélevé sur des souris et laissé coaguler pendant 45 à 60 minutes à température ambiante et centrifugé à 3 500 tr/min pendant 10 minutes pour obtenir du sérum. Le conjugué 17β-estradiol–HRP a été ajouté aux échantillons ou aux standards et incubé pendant 2 heures à 37 °C. Après lavage de tous les échantillons, le substrat TMB a été ajouté et incubé pendant 30 minutes supplémentaires à température ambiante. La réaction a été stoppée par l'ajout d'une solution d'arrêt et la DO a été mesurée à 450 nm pour quantifier la concentration de E2 à l'aide d'une courbe standard.

Le surnageant a été collecté à partir de BEC cultivés traités avec un véhicule (DMSO) ou du 17β-estradiol pour mesurer la concentration de TNFα (R&D Systems, MTA00B) et d'IL-6 (R&D Systems, M6000B) libérés par ELISA selon le protocole du fabricant. Spécifiquement, le diluant de test a été ajouté aux standards ou aux échantillons et incubé pendant 2 heures à température ambiante. Après lavage de tous les échantillons, le conjugué protéique respectif a été ajouté pendant 2 heures, suivi d'un autre lavage et d'une incubation avec une solution de substrat pendant 30 minutes. La DO a été mesurée à 540 nm et 450 nm (soustraite pour la correction de la longueur d'onde) et les concentrations de protéines ont été déterminées par une courbe standard.

Les fémurs ont été disséqués et écrasés avec un mortier et un pilon dans du PBS glacé. La solution de moelle osseuse a été passée à travers un filtre de 100 μm et culottée. La lyse des RBC (ChemCruz) a suivi comme expliqué ci-dessus. Les cellules ont été remises en suspension dans du PBS et colorées pour les EC totaux : anticorps primaire CD45 (BD Pharmingen, 1:100) ou EC de type H : anticorps primaire endomucine (Santa Cruz Biotechnology, 1:50) et anticorps secondaire Brilliant Violet-421 (Jackson ImmunoResearch , 1:50) avec CD31-PE (Miltenyi Biotec, 1:20) ou CD31-APC (Miltenyi Biotec, 1:20). La coloration mitochondriale a été réalisée après des incubations d'anticorps avec MitoSOX (Thermo Fisher Scientific, 1 μM) pendant 15 minutes à 37 ° C. Les cellules ont été passées dans le cytomètre en flux BD LSR II à l'aide du logiciel BD FACSDiva 9.0.0.

Pour la coloration FABP4, l'anti-FABP4-AF488 (Santa Cruz Biotechnology, 1:50) a été ajouté avec l'anti-CD31-PE après l'incubation primaire anti-CD45.

Pour la coloration Ki-67, les cellules ont été colorées comme expliqué ci-dessus pour l'endothélium total. Après coloration secondaire des anticorps et lavages, les cellules ont été fixées, perméabilisées (0,1 % de BSA et 0,01 % de saponine) et colorées avec FITC anti-souris Ki-67 (BioLegend, 1:75) pendant 45 minutes à température ambiante, et les cellules ont été acquises sur un cytomètre en flux BD LSR II.

Pour détecter les ions ferreux intracellulaires, les cellules ont été incubées avec FeRhoNox-1 (Goryo Chemical, 5 μM) pendant 15 minutes à 37 ° C après coloration des CE totales.

Les BEC en culture, traitées avec le véhicule (DMSO) ou le 17β-estradiol (10 μM) ont été trypsinisées, culottées et incubées avec soit du BODIPY 558/568 C12 (Thermo Fisher Scientific, 1 μM) soit du HCS LipidTOX Green (Thermo Fisher Scientific, 1 : 1 000) pendant 30 minutes à 37 °C avant l'acquisition.

Pour le capteur LPO, les cellules ont été colorées pour l'endothélium total, puis incubées avec BODIPY 665/676 (Thermo Fisher Scientific, 2 μg ml-1) pendant 30 minutes à 37 ° C avant l'acquisition.

Toutes les analyses de cytométrie en flux ont été effectuées à l'aide du logiciel FlowJo 10.0.0. Les CE totaux ont été contrôlés pour les populations CD31 + CD45 − Ter119 − et les CE de type H ont été contrôlés pour les populations Emcnhigh / CD31high.

Les BEC ont été ensemencées à environ 25 000 cellules par puits pour toutes les expériences de marquage radio-isotopique et ont été traitées avec du véhicule (DMSO) ou du 17β-estradiol pendant 48 heures avant le radiomarquage. Pour mesurer l'oxydation du glucose et de la glutamine, les cellules ont été incubées avec 0,3 μCi/ml de D-[6-14C]-glucose (PerkinElmer) ou 1,1 μCi/ml de L-[14C(U)]-glutamine (PerkinElmer) dans un milieu de culture cellulaire pour 6 heures. Pour arrêter le métabolisme cellulaire, 250 μl d'acide perchlorique ont été ajoutés dans chaque puits avec l'ajout d'un papier filtre imbibé d'hydroxyde d'hyamine pour absorber le 14CO2 libéré par l'oxydation du glucose ou de la glutamine pendant une nuit à température ambiante. La radioactivité a été déterminée par comptage à scintillation liquide pour indiquer les désintégrations par minute. Pour l'étude d'oxydation des FA, l'étomoxir a été utilisé pour inhiber CPT1A comme décrit précédemment. Pour mesurer l'oxydation du palmitate, les cellules ont été incubées avec 2 μCi/ml d'acide [9,10-3H]-palmitique (PerkinElmer) dans le milieu de culture cellulaire pendant 6 heures. Le milieu de culture cellulaire a été transféré dans des flacons en verre avec du papier filtre suspendu pour absorber le 3H2O libéré pendant 48 heures à 37 °C. La radioactivité a été déterminée par comptage à scintillation liquide (QuantaSmart) pour indiquer les désintégrations par minute.

Les piles Z d'images ont été reconstruites en 3D et analysées à l'aide du logiciel Imaris Image Analysis version 9.0.0. La quantification de la zone périlipine + et de type H a été effectuée à l'aide d'ImageJ (Fidji) sur la projection maximale des piles Z. Le nombre de cellules d'Osterix+ a été automatiquement compté à l'aide de la fonction de détection de points en définissant un diamètre seuil pour les noyaux d'osrerix+ afin d'exclure le bruit de fond à l'aide d'Imaris. Le volume des vaisseaux de type H a été quantifié à l'aide de la fonction de surfaces pour générer des chevauchements 3D des volumes Emcn + CD31 + dans Imaris. Les CE EdU+ ont été automatiquement comptées à l'aide de la détection de la fonction de points dans Imaris, de la même manière que les noyaux osterix+, après l'application d'un masque pour les vaisseaux sanguins Emcn+ à l'aide de la fonction de surfaces. Les CE Ki-67+ ont été quantifiées de manière similaire. L'intensité de fluorescence moyenne (MFI) pour Emcn+ 4-HNE et FABP4 a été générée automatiquement lors de la reconstruction 3D des piles Z pour l'analyse du volume en créant un masque pour les vaisseaux Emcn+. Les noyaux cellulaires CD31 + Ki-67 + ont été comptés à l'aide de la fonction de compteur de cellules dans ImageJ (Fidji). Le CD31 + 4-HNE (MFI) pour les cellules a été généré dans ImageJ (Fidji) en utilisant la densité intégrée et les valeurs de gris moyennes. La fluorescence de fond a été soustraite pour obtenir une intensité de fluorescence corrigée par cellule sur plusieurs images. Plin + ATGL et HSL (MFI) ont été calculés de la même manière, en utilisant la densité intégrée et les valeurs de gris moyennes par gouttelette lipidique sur plusieurs images pour 4 à 5 échantillons osseux.

Les CE ont été isolées avec des billes recouvertes d'anticorps, comme expliqué ci-dessus. Au lieu d'étaler des cellules pour la culture, les cellules ont été lysées avec un tampon RLT (Qiagen) et l'ARN a été extrait à l'aide du kit RNeasy Plus Micro (Qiagen, 74034) conformément aux directives du fabricant. L'ARN total a été converti en ADNc à l'aide du kit de synthèse d'ADNc iScript (Bio-Rad) conformément aux instructions du kit. L'ADNc dilué a été utilisé pour la qPCR réalisée à l'aide du SYBR Green Master Mix (Thermo Fisher Scientific) avec des amorces pour les gènes suivants : Tgfb, Eng, Tie1, Pecam1, Itga5, Flt4, Flt1, Fgfr2, Sox18, Nrp1, Adipoq, Fabp4, Cyp1b1, Lepr, Aldh1a2, TNFα et Il6. La β-actine a été utilisée comme gène domestique.

Pour confirmer la perte de fonction génique au niveau de la transcription pour les expériences de suppression de gène, les CE ont été isolées des fémurs de souris transgéniques injectées de tamoxifène pour qPCR en utilisant des amorces pour chaque gène (Esr1, Esr2, Gper1 et Cpt1a). Les séquences d'amorces utilisées dans cette étude sont fournies dans le tableau supplémentaire 1.

Les réactions ont été effectuées sur une machine de PCR en temps réel CFX (Bio-Rad) à l'aide du logiciel CFX manager 3.1. Les données ont été calculées à l'aide de la méthode ΔΔCt pour montrer l'expression du gène de repli ou les niveaux relatifs d'ARNm.

Les CE osseuses isolées ont été lysées à l'aide d'un tampon RLT. L'ARN a été extrait à l'aide du kit RNeasy Plus Micro conformément aux directives du fabricant.

La qualité de l'ARN pour chaque échantillon individuel a été vérifiée à l'aide d'un bioanalyseur 2100 (Agilent). Les trois meilleurs échantillons de chaque ensemble en fonction de la qualité de l'ARN ont été traités ultérieurement pour les préparations de la bibliothèque. Le kit de préparation de bibliothèque d'ARN total TruSeq (Illumina) a été utilisé pour préparer les bibliothèques, conformément aux directives du fabricant. Les bibliothèques ont été séquencées au LMS Genomics Facility sur une plate-forme Illumina HiSeq 2500 avec des lectures appariées de 100 nucléotides.

Analyse des données : les lectures d'ARN-seq de 100 pb appariées ont été alignées à l'aide de l'assemblage du génome de souris GRCm39 STAR (version 2.7.10a)45. Le nombre de lectures basées sur les gènes a été obtenu à l'aide de featureCounts (version 2.0.1)46. Les données de comptage ont été normalisées à l'aide de la fonction de transformation de stabilisation de la variance (VST) du package DESeq247 pour la visualisation par PCA. L'analyse différentielle de l'expression génique entre les hommes et les femmes pour chaque groupe d'âge a été réalisée à l'aide de DESeq2. Les gènes DE ont été sélectionnés (codant pour les protéines) à l'aide d'un P <0,05 ajusté au taux de fausses découvertes (FDR). De plus, les identifiants Ensembl ont été annotés en symboles de gène et Entrez Gene ID à l'aide de biomaRt (réf. 48). La liste des gènes à régulation différentielle est fournie dans l'ensemble de données supplémentaire 1. L'analyse d'enrichissement de l'ensemble de gènes a été réalisée à l'aide de GAGE ​​(version 2.42.0)19. Pour l'annotation fonctionnelle, nous avons utilisé des ensembles de gènes de la base de données KEGG. L'analyse GAGE ​​a été réalisée sur des gènes régulés de manière différentielle à partir de 65 semaines de données, où l'échantillon féminin a été prélevé comme échantillon de référence. Les termes KEGG significatifs ont été sélectionnés en utilisant P < 0,05.

GraphPad Prism version 9.4.1 a été utilisé pour générer tous les graphiques et pour l'analyse statistique. Les statistiques réalisées pour chaque figure sont mentionnées dans la légende de la figure correspondante. Le cas échéant, des tests t non appariés bilatéraux de Student ou une ANOVA unidirectionnelle ou bidirectionnelle après le test de comparaison multiple de Tukey ont été effectués pour les ensembles de données. Les barres d'erreur pour les données biologiques indiquent la moyenne ± sd et, pour la quantification numérique, les barres d'erreur indiquent la moyenne ± sem P < 0,05 a été considérée comme statistiquement significative. La taille des échantillons a été sélectionnée sur la base d'expériences antérieures et de données publiées. Toutes les données ont été générées à l'aide d'au moins deux expériences indépendantes pour reproduire des résultats similaires.

De plus amples informations sur la conception de la recherche sont disponibles dans le résumé des rapports de recherche sur la nature lié à cet article.

Les données d'ARN-seq générées pour cette étude ont été déposées dans la base de données Omnibus du National Center for Biotechnology Information Gene Expression sous les numéros d'accession GSE163515 et GSE180246. Des données supplémentaires à l'appui des conclusions de cette étude sont incluses dans l'article principal et les fichiers associés. Les données sources sont fournies avec ce document.

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Nous remercions P. Carmeliet, SA Khan et RH Adams pour avoir fourni des lignées de souris et P. Carmeliet et G. Eelen pour avoir fourni le protocole de dosage radioactif. Nous remercions R. Eastell, I. Miguel-Aliaga et tous les membres du laboratoire Ramasamy pour des discussions judicieuses. SKR est Sir Henry Dale Fellow du Wellcome Trust et de la Royal Society (202300/Z/16/Z). SKR reconnaît que cette recherche a été financée en partie par le Wellcome Trust (202300/Z/16/Z), la Royal Society (RGS\R2\212421), le Medical Research Council (A654-5QC60) et l'American Society for Bone and Recherche minérale. L'APK reconnaît que le travail est soutenu en partie par le Medical Research Council (CDA : MR/P02209X/1) et le Conseil européen de la recherche (StG : metaNiche, 805201). SKR est membre du programme EMBO Young Investigator. Aux fins du libre accès, nous avons appliqué une licence de droit d'auteur public CC BY à toute version de manuscrit accepté par l'auteur résultant de cette soumission.

Institut des sciences cliniques, Imperial College London, Londres, Royaume-Uni

Julia Rodrigues, Michelle Hendriks et Saravana K. Ramasamy

MRC London Institute of Medical Sciences, Imperial College London, Londres, Royaume-Uni

Julia Rodrigues, Michelle Hendriks et Saravana K. Ramasamy

Bioinformatics and Computing Facility, MRC London Institute of Medical Sciences, Imperial College London, Londres, Royaume-Uni

Yi-Fang Wang et Gopuraja Dharmalingam

Groupe des microenvironnements tissulaires et tumoraux, Unité d'immunologie humaine du MRC, Institut de médecine moléculaire du MRC Weatherall, Université d'Oxford, Oxford, Royaume-Uni

Amit Singh et Anjali P. Kusumbe

Centre de biochimie de l'Université de Heidelberg, Université de Heidelberg, Heidelberg, Allemagne

Amit Singh

Bioscar Inserm U1132 and Université de Paris, Hospital Lariboisiere, Paris, France

Martine Cohen Solal

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JR a conçu et réalisé la plupart des expériences, interprété les résultats et préparé les figures. Y.-FW, AS et GD ont analysé les données d'expression des gènes. MH a trié les cellules et préparé le manuscrit. APK a conçu des expériences et interprété les résultats. Tous les auteurs ont préparé le manuscrit. SKR a conçu et supervisé l'étude, interprété les résultats et rédigé le manuscrit.

Correspondance à Saravana K. Ramasamy.

Les auteurs déclarent une absence d'intérêts financiers en compétition.

Nature Cardiovascular Research remercie Philip Shaul, Joshua Farr et les autres examinateurs anonymes pour leur contribution à l'examen par les pairs de ce travail.

Note de l'éditeur Springer Nature reste neutre en ce qui concerne les revendications juridictionnelles dans les cartes publiées et les affiliations institutionnelles.

a, Images confocales représentatives montrant des changements dans les OBL (Osterix +) et les adipocytes de la moelle osseuse (BM) (Perilipin +) à différents moments pendant la grossesse et le post-partum de la souris. Barres d'échelle 40 μm. b, Quantification des OBL et des adipocytes BM décrits en a, normalisés respectivement à la longueur et à la surface de la métaphyse (mp) (n = 5). Les données sont moyennes ± sd ; ANOVA à un facteur avec le test de Tukey. c, Quantification des CE Ki-67 + à différents moments pendant la grossesse de la souris, normalisée à la longueur de mp (n = 5). Les données sont moyennes ± sd ; ANOVA à un facteur avec le test de Tukey. d, Images confocales représentatives avec quantifications (n ​​= 5) montrant la perte d'OBL et l'augmentation des adipocytes BM dans le modèle VCD. Les données sont moyennes ± sd ; Test t bilatéral non apparié. Barres d'échelle 40 μm. e, scans de carreaux confocaux représentatifs du véhicule et des os traités à l'E2 à P28, illustrant l'augmentation des vaisseaux de type H (têtes de flèches) chez les souris traitées à l'E2. Des lignes pointillées blanches séparent la moelle osseuse de la région de l'os cortical. Quantification des CE de type H (CD31high Emcnhigh) caractérisées par cytométrie en flux (n = 6). Les données sont moyennes ± sem ; ANOVA bidirectionnelle avec test de Tukey. Barres d'échelle 100 μm.

Données source

a, Images confocales représentatives avec quantifications des OBL (Osterix+, n = 5) et des adipocytes BM (Perilipin +, n = 5) de souris traitées avec différentes hormones à P28. Les données sont moyennes ± sd ; ANOVA bidirectionnelle avec test de Tukey. Barres d'échelle 40 μm. b, des images confocales représentatives montrent des vaisseaux sanguins d'endomucine (Emcn, rouge), CD31 (vert), d'actine musculaire lisse alpha (αSMA, cyan) dans la métaphyse et la zone osseuse corticale. Les graphiques montrent la quantification des artérioles CD31 + Emcn- (têtes de flèches blanches) et des TCV chez les souris traitées avec le véhicule, E2, P4 et DHT (n = 5) ; Les données sont moyennes ± sd ; ANOVA bidirectionnelle avec test de Tukey. Les lignes pointillées blanches indiquent la région de l'os cortical. Le DAPI est un contre-colorant nucléaire. Barres d'échelle 100 μm (TCV); 50 μm (artérioles). c, Images confocales représentatives du véhicule injecté par EdU et des souris traitées par E2 à P28, avec quantification des CE EdU + normalisées à la longueur de la métaphyse (mp) (véhicule n = 4 F, n = 4 M ; E2 n = 5 F, n = 4 M) indiquant une augmentation des CE EdU + avec le traitement E2. Barres d'échelle 50 μm. Parcelles représentatives de cytométrie en flux des CE Ki-67+, avec quantification des CE Ki-67+ dans l'os (véhicule n = 4 F, n = 4 M ; E2 n = 6 F, n = 4 M) indiquant une augmentation de Ki- 67+ CE avec traitement E2. Les données de quantification d'image sont moyennes ± sd avec ANOVA à deux voies avec le test de Tukey, et les données de cytométrie en flux signifient ± sem avec ANOVA à deux voies avec le test de Tukey. d, Images confocales représentatives et quantification des noyaux Ki-67 + du véhicule et des BEC traités à l'E2 (véhicule n = 11, E2 n = 10) avec quantification de la moyenne à partir de plusieurs champs de vision 20x indiquant une augmentation des cellules Ki-67 + avec traitement E2. Les données sont moyennes ± sd ; Test t bilatéral non apparié. Barres d'échelle 50 μm. e, graphique montrant l'expression génique relative pour les gènes angiogéniques chez les souris traitées avec le véhicule et E2, indiquant une augmentation de l'angiogenèse lors du traitement E2. (Tgfb Véhicule n = 8, E2 n = 5 ; Eng Véhicule n = 8, E2 n = 5 ; Tie1 Véhicule n = 6, E2 n = 5 ; Pecam1 Véhicule n = 8, E2 n = 5 ; Itga5 Véhicule n = 7 , E2 n = 5 ; Véhicule Flt4 n = 8, E2 n = 5 ; Véhicule Flt1 n = 5, E2 n = 4 ; Véhicule Fgfr2 n = 7, E2 n = 6 ; Véhicule Sox18 n = 8, E2 n = 8 ; Nrp1 Véhicule n = 7, E2 n = 6.) Les données sont moyennes ± sem ; Test t bilatéral non apparié multiple.

Données source

a, graphique montrant la concentration sérique d'E2 à différents moments pendant la grossesse de la souris (n = 6 pour dpc10.5, dpc17.5 ; n = 5 pour Male, Virgin F, dpc5.5, dpp0, dpp7). Les données sont moyennes ± sem ; ANOVA à un facteur avec le test de Tukey. b, graphique montrant la concentration sérique d'E2 chez les souris P28 (n = 4 F, n = 4 M) et âgées (n = 8 F, n = 7 M). Les données sont moyennes ± sem ; ANOVA bidirectionnelle avec le test de Tukey. c, Images confocales représentatives avec quantifications des vaisseaux sanguins de type H (jaune, Emcnhigh CD31high) (n = 5 pour toutes les conditions), des OBL (Osterix +, n = 5) et des adipocytes BM (Perilipin +, n = 5) dans Souris opérées de manière fictive et OVX traitées par véhicule et E2. La quantification par cytométrie en flux des CE totales (CD31 + CD45-Ter119-) montre la récupération des BEC dans les os traités à l'E2 (n = 5). Les données sont moyennes ± sd pour la quantification d'image et moyenne ± sem pour les données de cytométrie en flux. ANOVA bidirectionnelle avec le test de Tukey. Barres d'échelle 50 μm. d, des coupes de tissu osseux de souris traitées au véhicule et au létrozole à P28 ont été immunocolorées avec CD31 (vert) et Emcn (rouge) pour identifier les vaisseaux de type H. Le graphique montre les quantifications des vaisseaux sanguins de type H (jaune) (n = 4). La distribution des OBL et des adipocytes BM dans ces coupes osseuses a été imagée à l'aide d'Osterix + (cyan) et Perilipin (vert). Les graphiques montrent la quantification des OBL (n = 4) et des adipocytes (n = 4) chez les souris traitées au véhicule et au létrozole. Les données sont moyennes ± sd ; ANOVA bidirectionnelle avec le test de Tukey. Barres d'échelle 50 μm.

Données source

a, Graphiques indiquant les niveaux relatifs d'ARNm des récepteurs des œstrogènes (Esr1, Esr2, Gper1) dans les BEC femelles et mâles à P28. (Esr1 : n = 8 F, n = 7 M ; Esr2, Gper1 : n = 7) Les données sont moyennes ± sem ; Test t bilatéral non apparié. b, Graphiques montrant les niveaux de transcription ER dans les BEC purifiés du mutant de délétion endothélial Esr1, Esr2 ou Gper1 et des compagnons de la même portée (Contrôle Esr1 n = 6 F, n = 6 M, Mutant n = 5 F, n = 5 M; Contrôle Esr2 n = 5 F, n = 5 M, Mutant n = 6 F, n = 5 M ; Contrôle Gper1 n = 5 F, n = 6 M, Mutant n = 5 F, n = 6 M). Les données sont moyennes ± sem ; ANOVA bidirectionnelle avec test de Tukey. c, Images confocales représentatives de mutants avec délétion endothéliale Esr1, Esr2 ou Gper1 par rapport aux témoins Cre de la même portée, avec des quantifications montrant la perte d'OBL et l'augmentation des adipocytes après la délétion Esr1 et Gper1 (Esr1: Osx-Control n = 10 F, n = 7 M, Mutant n = 9 F, n = 6 M ; Esr1 : Contrôle Plin n = 9 F, n = 8 M, Mutant n = 8 F, n = 8 M ; Esr2 : Contrôle Osx n = 5 F, n = 5 M, Mutant n = 6 F, n = 5 M ; Esr2 : Contrôle Plin n = 5 F, n = 5 M, Mutant n = 6 F, n = 6 M ; Gper1 : à la fois Osx et Plin- Contrôle n = 6 F, n = 7 M, Mutant n = 7 F, n = 7 M). Les données sont moyennes ± sd ; ANOVA bidirectionnelle avec test de Tukey. Barres d'échelle 40 μm.

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a, Analyse microCT représentative de mutants avec délétion endothéliale Esr1 par rapport aux témoins Cre- de la même portée, avec des quantifications montrant la fraction de volume d'os trabéculaire (BV/TV), le nombre, l'épaisseur et la séparation (n = 4), la quantification des adipocytes (n = 4) et quantification de l'épaisseur et de la surface de l'os cortical (n = 4). Les images confocales représentatives montrent la distribution des ostéoclastes dans les os témoins et mutants avec quantification du nombre d'ostéoclastes (n = 6) et de la couverture (n = 5). Les données sont moyennes ± sem pour les résultats micro-CT et ± sd pour la quantification d'image ; ANOVA bidirectionnelle avec test de Tukey. Barres d'échelle 100 μm (microCT), 50 μm (confocal). b, Images microCT représentatives de mutants avec délétion endothéliale Gper1 par rapport aux témoins Cre de la même portée, avec des quantifications montrant la fraction de volume osseux trabéculaire (BV/TV), le nombre, l'épaisseur et la séparation (n = 4), la quantification des adipocytes (n = 4 ) et quantification de l'épaisseur et de la surface de l'os cortical (n = 4). Les images confocales représentatives montrent la distribution des ostéoclastes dans les os témoins et mutants avec quantification du nombre d'ostéoclastes (n = 6) et de la couverture (n = 5). Les données sont moyennes ± sem pour les résultats micro-CT et ± sd pour la quantification d'image ; ANOVA bidirectionnelle avec test de Tukey. Barres d'échelle 100 μm (microCT), 50 μm (confocal).

Données source

a, tracé PCA des données RNAseq montrant le regroupement de BEC mâles et femelles purifiés de souris âgées de 2 semaines, 12 semaines et 65 semaines (n = 3). Un exemple de carte thermique de corrélation du modèle d'expression génique montre le regroupement des groupes d'âge. b, Heatmap montrant les gènes associés au métabolisme des acides gras, qui sont exprimés de manière différentielle dans les BEC de souris âgées entre les mâles et les femelles. c, Images confocales représentatives montrant les types de cellules dans le microenvironnement BM des mutants Cpt1a avec des graphiques montrant la quantification des cellules Osterix+ par mm de mp (Contrôle n = 6 F, n = 7 M ; Mutant n = 6 F, n = 6 M) ; Zone périlipine + par zone mm2 (Contrôle n = 5 F, n = 6 M; Mutant n = 5 F, n = 5 M). Des images microCT représentatives avec quantification montrent une augmentation du volume des adipocytes BM chez les mutants Cpt1a (n = 4). Les données sont moyennes ± sd pour la quantification d'image et moyenne ± sem pour les données microCT ; ANOVA bidirectionnelle avec test de Tukey. Barres d'échelle 100 μm (microCT), 40 μm (confocal). d, des images confocales représentatives montrent des cellules Osx + et des adipocytes Perilipin + chez des souris mâles mutantes Cpt1aiΔEC traitées avec E2. Les graphiques montrent les quantifications des cellules Osx+ par mm de mp (n = 5) et des cellules Perilipin+ par mm2 (n = 5). Les données sont moyennes ± sd ; ANOVA bidirectionnelle avec test de Tukey. Barres d'échelle 50 μm.

Données source

a, les immunomarquages ​​montrent l'expression de FABP4 (vert) dans les vaisseaux sanguins (Emcn, rouge) du véhicule et du tibia traité par E2 des souris mâles et femelles (n = 7). Barres d'échelle 50 μm. b, Images confocales représentatives de l'absorption des lipides des FA synthétiques conjugués à BODIPY dans les BEC traités avec le véhicule et l'E2 (n = 4), avec quantification par cytométrie en flux indiquant une augmentation de l'absorption des lipides avec le traitement à l'E2. Les données sont moyennes ± sem ; Test t bilatéral non apparié. Barres d'échelle 15 μm. c, images confocales représentatives des niveaux de lipides intracellulaires dans les BEC traités avec le véhicule et l'E2. Le graphique montre la quantification par cytométrie en flux des BEC ayant des niveaux élevés de LipidTOX (n = 4) dans des conditions de véhicule et E2. Les données sont moyennes ± sem ; Test t bilatéral non apparié. Barres d'échelle 15 μm. d, images confocales représentatives de l'absorption lipidique des FA synthétiques conjugués à BODIPY dans les BEC traités par le véhicule et E2 lors du traitement par l'inhibiteur GPER1 G36. La quantification montre des unités de fluorescence réduites de BODIPY endothéliales lors de l'inhibition de GPER1, sur plusieurs champs de vision 63x (véhicule n = 37, véhicule + G36 n = 30 ; E2 n = 39, E2 + G36 n = 30). Les données sont moyennes ± sd ; ANOVA bidirectionnelle avec le test de Tukey. Barres d'échelle 15 μm. e, Images confocales représentatives et quantification des niveaux endothéliaux de FABP4 chez des souris présentant des délétions des récepteurs aux œstrogènes Esr1 (Contrôle n = 6 F, n = 6 M; Mutant n = 6 F, n = 6 M) et Gper1 (Contrôle n = 6 F , n = 6 M ; mutant n = 6 F, n = 6 M). Les données sont moyennes ± sd ; ANOVA bidirectionnelle avec le test de Tukey. Les niveaux relatifs de transcription de Fabp4 ont également été quantifiés dans les cellules endothéliales purifiées des mutants endothéliaux GPER1 (n = 4) et ESR1 (n = 4) par rapport à leur témoin de même portée. Les données sont moyennes ± sem ; ANOVA bidirectionnelle avec le test de Tukey. Barres d'échelle 50 μm.

Données source

a, Images confocales représentatives des adipocytes BM (cellules périlipine +) et des enzymes lipolytiques (ATGL et HSL) dans les os mutants Cpt1a et Gper1 et leurs compagnons de litière respectifs. Barres d'échelle 50 μm. Les graphiques montrent avec des quantifications de fluorescence indiquant une diminution des enzymes lipolytiques (ATGL et HSL) dans Cpt1a (ATGL : Contrôle n = 23 F, 15 M ; Mutant n = 23 F, 24 M. Contrôle HSL n = 19 F, 36 M ; Mutant n = 42 F, 54 M), Gper1 (ATGL : Contrôle n = 13 F, 12 M ; Mutant n = 17 F, 21 M. HSL : Contrôle n = 19 F, 50 M ; Mutant n = 37 F, 49 M ) et Esr1 (ATGL : contrôle n = 75 F, 72 M ; mutant n = 63 F, 62 M. HSL : contrôle n = 127 F, 79 M ; mutant n = 106 F, 60 M) suppression, par cellule sur plusieurs Champs de vision 20x. Les données sont moyennes ± sd ; ANOVA bidirectionnelle avec test de Tukey. b, Graphiques montrant les niveaux relatifs de transcription des ARNm de Tnfa et Il6 dans des BEC isolés de souris traitées par E2 (véhicule n = 5 F, n = 5 M ; E2 n = 5 F, n = 5 M) et suppression endothéliale Cpt1a et Gper1 mutants (contrôle n = 4 F, n = 4 M ; mutant n = 4 F, n = 4 M). Les données sont moyennes ± sem ; ANOVA bidirectionnelle avec test de Tukey. c, Graphique montrant l'augmentation des niveaux de TNFα (véhicule n = 12, E2 n = 12, E2 + G36 n = 6) et d'IL-6 (véhicule n = 12, E2 n = 12, E2 + G36 n = 6) quantifiés à partir de la cellule surnageants de culture de BEC traités avec le véhicule, E2 et E2 + G36. Les données sont moyennes ± sem ; ANOVA à un facteur avec le test de Tukey.

Données source

a, des images confocales représentatives montrent des vaisseaux de type H (jaune, Emcnhigh CD31high), des OBL (Osterix +) et des adipocytes BM (Perilipin +) chez des souris âgées traitées avec E2 (véhicule n = 5 F, n = 5 M; E2 n = 5 F , n = 5 M). Barres d'échelle 40 μm. Les graphiques montrent la quantification des CE totales, des vaisseaux de type H, des cellules Osx+ et Perilipin+ dans les os des souris traitées avec le véhicule et E2. Les données sont moyennes ± sem pour les données de cytométrie en flux et moyennes ± sd pour la quantification d'image, ANOVA à deux voies avec le test de Tukey. b, images confocales de coupes osseuses immunocolorées pour CD31 (vert), endomucine (rouge), actine alpha-musculaire lisse (αSMA, cyan) montrent la distribution de CD31 + Emcn- arterioles et TCV chez des souris âgées traitées avec le véhicule et l'E2. Les graphiques de quantification montrent une augmentation des artérioles et des TCV (n = 5) après administration d'E2 chez la souris ; Les données sont moyennes ± sd ; ANOVA bidirectionnelle avec test de Tukey. Barres d'échelle 50 μm (artérioles), 100 μm (TCV). c, images confocales représentatives des niveaux de 4HNE dans l'endothélium osseux du véhicule et des souris jeunes (P28 ; n = 8) et âgées (> 60 semaines ; n = 4) traitées à l'E2. Les images montrent un médaillon représentant l'expression endothéliale de 4HNE illustrée par des pointes de flèches. Barres d'échelle 50 μm. d, modèle de ménopause VCD avec encarts indiquant l'expression endothéliale de 4HNE illustrée par des pointes de flèches (véhicule n = 5 ; VCD n = 5). Les données sont moyennes ± sd ; Test t bilatéral non apparié. Barres d'échelle 50 μm.

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a, Images confocales représentatives de l'expression endothéliale de FABP4 chez des souris âgées (n = 5), montrant une augmentation après traitement E2. Les données sont moyennes ± sd ; ANOVA bidirectionnelle avec le test de Tukey. Barres d'échelle 50 μm. b, Images confocales représentatives avec quantification des niveaux de 4HNE dans les cellules endothéliales osseuses traitées avec le véhicule et l'inhibiteur de FABP4 BMS 309403 en présence de E2. La quantification a montré des niveaux élevés de 4HNE lors de l'inhibition de FABP4, qui n'ont pas été récupérés par le traitement E2 (n = 6). Les données sont moyennes ± sd ; ANOVA bidirectionnelle avec le test de Tukey. Barres d'échelle 15 μm. c, Images confocales représentatives de BEC traités avec le contrôle, la déféroxamine (DFM) ou l'artémisinine (Art). Le graphique montre la quantification de l'intensité de fluorescence des niveaux de 4HNE endothéliale (Véhicule n = 24, E2 n = 26 ; Véhicule+DFM n = 26 ; E2 + DFM n = 27 ; Véhicule+Art n = 21 ; E2 + Art n = 23) sont moyennes ± sd ; ANOVA bidirectionnelle avec le test de Tukey. Barres d'échelle 15 μm. d, Images confocales représentatives avec quantification des niveaux de 4HNE dans l'endothélium osseux du véhicule (n = 5 F, n = 5 M) et souris traitées au DFM (n = 5 F, n = 6 M) à P28. Les données sont moyennes ± sd ; ANOVA bidirectionnelle avec le test de Tukey. Barres d'échelle 50 μm. e, Les images confocales montrent les vaisseaux de type H, les OBL et l'expression de la périlipine dans les microenvironnements BM de souris traitées avec de l'artémisinine (Art). Graphiques montrant la quantification du volume des vaisseaux de type H par champ de mp (Véhicule n = 4 F, n = 5 M ; Artémisinine n = 4 F, n = 6 M), cellules Osterix+ par mm de mp (Véhicule n = 5 F, n = 7 M ; Artémisinine n = 5 F, n = 6 M), et Zone périlipine+ par zone mp (Véhicule n = 5 F, n = 5 M ; Artémisinine n = 5 F, n = 6 M). Les données sont moyennes ± sd ; ANOVA bidirectionnelle avec le test de Tukey. Barres d'échelle 50 μm. f, des images représentatives en microCT 3D montrent des os corticaux de souris mâles âgées traitées avec le véhicule et la Liproxstatine-1 (Lip-1). Les graphiques montrent l'épaisseur de l'os cortical (en mm) et la surface de l'os cortical de souris mâles et femelles âgées traitées avec le véhicule (n = 4 F, 4 M) et la Liproxstatine-1 (n = 4 F, 4 M). Les données sont moyennes ± sem ; ANOVA bidirectionnelle avec le test de Tukey. Barres d'échelle 100 μm.

Données source

Fig. supplémentaires. 1 et 2

Données d'expression génique comparant les BEC masculins et féminins à différents moments

Séquences d'amorce utilisées dans l'étude

Données de base statistiques

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Réimpressions et autorisations

Rodrigues, J., Wang, YF., Singh, A. et al. L'œstrogène renforce l'intégrité des vaisseaux sanguins dans l'os pendant la grossesse et la ménopause. Nat Cardiovasc Res 1, 918–932 (2022). https://doi.org/10.1038/s44161-022-00139-0

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Reçu : 17 janvier 2022

Accepté : 02 septembre 2022

Publié: 12 octobre 2022

Date d'émission : Octobre 2022

DOI : https://doi.org/10.1038/s44161-022-00139-0

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