Un stéroïde mâle contrôle le comportement sexuel féminin chez le moustique du paludisme

Nature volume 608, pages 93–97 (2022)Citer cet article

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Les insectes, contrairement aux vertébrés, sont largement considérés comme dépourvus d'hormones stéroïdes sexuelles mâles1. Chez le moustique du paludisme Anopheles gambiae, l'ecdystéroïde 20-hydroxyecdysone (20E) semble avoir évolué à la fois pour contrôler le développement des œufs lorsqu'il est synthétisé par les femelles2 et pour induire une réfractaire à l'accouplement lorsqu'il est sexuellement transféré par les mâles3. Parce que le développement des œufs et l'accouplement sont des traits reproducteurs essentiels, comprendre comment les femelles anophèles intègrent ces signaux hormonaux peut stimuler la conception de nouveaux programmes de lutte contre le paludisme. Nous révélons ici que ces fonctions reproductives sont régulées par des stéroïdes sexuels distincts à travers un réseau sophistiqué d'enzymes activant/inactivant les ecdystéroïdes. Nous identifions un ecdystéroïde oxydé spécifique aux hommes, le 3-déshydro-20E (3D20E), qui protège la paternité en désactivant la réceptivité sexuelle féminine après son transfert sexuel et son activation par déphosphorylation. Notamment, le transfert de 3D20E induit également l'expression d'un gène reproducteur qui préserve le développement des œufs pendant l'infection à Plasmodium, assurant ainsi la forme physique des femelles infectées. Le 20E dérivé de la femelle ne déclenche pas la réfraction sexuelle, mais autorise plutôt la ponte chez les individus accouplés une fois qu'une kinase inhibant le 20E est réprimée. L'identification de cette hormone stéroïde spécifique aux insectes mâles et de ses rôles dans la régulation de la réceptivité sexuelle féminine, de la fertilité et des interactions avec les parasites Plasmodium suggère la possibilité de réduire le succès reproducteur des moustiques transmettant le paludisme.

Les cas et les décès dus au paludisme sont à nouveau en hausse4 en raison de plusieurs facteurs, notamment la résistance généralisée aux insecticides chez les moustiques anophèles, qui sont les seuls vecteurs des parasites du paludisme humain. La biologie d'accouplement de ces moustiques est une cible particulièrement intéressante pour les nouvelles interventions de lutte contre le paludisme, car les femelles ne s'accouplent qu'une seule fois5 ; rendre cet événement d'accouplement unique stérile aurait un énorme potentiel pour réduire les populations de moustiques sur le terrain.

Les femelles perdent leur réceptivité sexuelle après avoir reçu des titres élevés d'hormones stéroïdes de la part des mâles. Des études ont suggéré que le déclencheur de la réfractaire à la poursuite de l'accouplement est la 20-hydroxyecdysone (20E)3, une hormone stéroïde mieux connue comme régulateur des cycles de mue au cours des stades larvaires6. La capacité des mâles à synthétiser et à transférer 20E a évolué spécifiquement dans un sous-ensemble d'espèces d'anophèles du sous-genre Cellia7, qui peuple l'Afrique et comprend les vecteurs du paludisme les plus dangereux, y compris Anopheles gambiae5. Ceci est particulièrement remarquable car, chez ces espèces, le 20E est également produit par les femelles après chaque repas de sang, le 20E entraînant les cycles oogénétiques (examiné dans la réf. 8). Cependant, la manière dont les femelles intègrent les signaux provenant de deux sources différentes d'ecdystéroïdes (mâle transféré et induit par l'alimentation sanguine) sans altérer leur propre capacité à s'accoupler est mal comprise. En effet, si la réfractaire sexuelle devait être déclenchée par le 20E produit par la femelle, cela entraînerait la stérilité chez les individus qui se nourrissent de sang vierges, ce qui est un comportement très courant chez ces moustiques5.

Une explication possible est que les mâles d'A. gambiae transfèrent un ecdystéroïde modifié spécifique aux mâles qui active les cascades de signalisation dans l'appareil reproducteur femelle, conduisant à une réfractaire à l'accouplement. Cependant, alors que les vertébrés ont plusieurs classes d'hormones stéroïdes largement dimorphes telles que les œstrogènes et les androgènes (examinés dans la réf. 9), les stéroïdes à tendance masculine n'ont pas été identifiés chez les insectes, à notre connaissance.

Nous avons entrepris de déterminer la composition complète des hormones stéroïdes dans les glandes accessoires mâles (MAG) des mâles A. gambiae sexuellement matures, à la recherche d'éventuels stéroïdes modifiés. En utilisant la chromatographie liquide à haute performance couplée à la spectrométrie de masse en tandem (HPLC-MS/MS) plutôt que les méthodes moins spécifiques précédemment utilisées7,10,11, nous avons détecté de l'ecdysone (E) et du 20E dans ce tissu, confirmant les résultats précédents. Cependant, les échantillons étaient dominés par un stéroïde phosphorylé oxydé correspondant à la formule chimique 3-déshydro-20E-22-phosphate (3D20E22P)12 (Fig. 1). D'autres formes comprenaient le 3-déshydro-20E (3D20E) et le 20E-22-phosphate (20E22P). L'intensité du signal HPLC – MS / MS de 3D20E22P était de deux ordres de grandeur supérieure à celle de sa forme déphosphorylée 3D20E et de trois ordres de grandeur supérieure à celle de E et 20E (Fig. 1). Aucun niveau détectable de 3D20E22P ou 3D20E n'a été trouvé chez les femelles nourries au sang, bien que E et 20E (et de faibles niveaux de 20E22P) aient été détectés dans le reste du corps, comme prévu11, et dans l'appareil reproducteur inférieur (LRT ; Extended Data Fig .1a). Nous avons également profilé les ecdystéroïdes chez les hommes et les femmes nouvellement écloses (<1 jour) et détecté 3D20E et 3D20E22P uniquement dans les MAG ; E, 20E et 20E22P étaient présents chez les deux sexes (données étendues Fig. 1b). Ces données démontrent que les mâles adultes d'A. gambiae produisent des titres élevés d'hormones modifiées dans leurs MAG qui ne sont pas synthétisées par les femelles.

Les MAG et les LRT femelles (englobant l'oreillette, la spermathèque et le parovarium) ont été disséqués à partir de mâles vierges de 4 jours (4 jours) et de femelles vierges et accouplées (à 0,5, 3 et 12 hpm). Les ecdystéroïdes dans ces tissus ont été analysés par HPLC–MS/MS (moyenne ± sem ; test t non apparié, recto-verso, taux de fausses découvertes (FDR) corrigé ; NS, non significatif ; *P < 0,05, **P < 0,01 3D20E : 3 h versus 0,5 h, P = 0,035 ; 12 h versus 3 h, P = 0,0015 ; 12 h versus 0,5 h, P = 0,030. 3D20E22P : 3 h versus 0,5 h, P = 0,25 ; 12 h versus 3 h , P = 0,0032 ; 12 h contre 0,5 h, P = 0,015). Les données ont été regroupées à partir de trois répétitions biologiques. La surface du pic a été calculée pour chaque ecdystéroïde d'intérêt et normalisée par le nombre de moustiques. Les ecdystéroïdes sont indiqués par la couleur comme suit : E, vert ; 20E, orange ; 20E22P, violet ; 3D20E, bleu ; 3D20E22P, rose. Les encarts augmentent l'échelle sur l'axe des ordonnées pour montrer les niveaux d'ecdystéroïdes inférieurs.

Données source

Pour déterminer si 3D20E22P et 3D20E sont transférés pendant l'accouplement, nous avons disséqué le LRT femelle à différents moments après l'accouplement. Alors qu'aucun ecdystéroïde n'a été identifié chez les vierges, nous avons observé une grande quantité de 3D20E22P dans le LRT immédiatement après la copulation (0,5 h après l'accouplement, hpm), qui a diminué avec le temps parallèlement à une augmentation significative des niveaux de 3D20E (Fig. 1). En utilisant le 3D20E synthétisé chimiquement comme standard, nous avons déterminé que les niveaux de cette hormone stéroïde dans le LRT accouplé étaient au moins 100 fois plus élevés que ceux du 20E (Extended Data Table 1). 3D20E22P est donc le principal ecdystéroïde mâle transféré à la LRT femelle lors de l'accouplement, et sa forme déphosphorylée 3D20E devient très abondante peu après l'accouplement. Cela suggère un rôle prédominant de ce dernier ecdystéroïde dans la biologie post-accouplement de la femelle.

À l'aide d'un pipeline bioinformatique personnalisé après la génération de nouveaux ensembles de données de séquençage d'ARN (ARN-seq) (Fig. 2a), nous avons recherché des gènes codant pour les ecdystéroïdes kinases (EcK), les ecdysone oxydases (EO) et les ecdystéroïdes phosphate phosphatases ( EPP) exprimée dans les tissus reproducteurs. Nous avons identifié un gène candidat EPP et deux gènes EcK potentiels (EcK1 et EcK2), mais nous n'avons pas pu trouver un bon gène candidat EO. Notamment, le gène EPP unique était exprimé à des niveaux élevés (98, 9e centile) dans les MAG d' A. gambiae mais pas dans le LRT femelle (Fig. 2b), contrairement à nos attentes étant donné que la déphosphorylation de 3D20E22P se produit dans ce tissu femelle. Nous avons donc considéré que l'EPP mâle pouvait être transférée lors de la copulation. En effet, nous avons identifié cette enzyme par MS dans l'oreillette des femelles après l'accouplement en utilisant un marquage isotopique stable in vivo pour masquer les protéines femelles (Fig. 2c et Tableau supplémentaire 1). La présence d'EPP dans les MAG et dans les LRT femelles accouplées (mais non vierges) a également été confirmée à l'aide d'un anticorps spécifique (Fig. 2d).

a, Le pipeline bioinformatique personnalisé utilisé pour rechercher les gènes codant pour les EcK, les EO et les EPP dans les tissus reproducteurs de chaque sexe. Les nombres à côté des flèches indiquent le nombre de candidats masculins et féminins à chaque étape. Cette analyse a identifié un gène EPP (EPP) et un gène EcK (EcK1) exprimés chez les mâles, et un gène EcK (EcK2) exprimé chez les deux sexes mais n'a pas donné de gène EO candidat. b, Carte thermique comparant l'expression des gènes candidats dans les tissus d'A. gambiae vierge (V) et accouplée (M) et d'Anopheles albimanus. Spca, spermathèque ; MAG, glandes accessoires mâles ; corps, le reste du corps comprenant le thorax, les ailes, les pattes, le corps gras et les tripes chez les deux sexes et les ovaires chez les femelles. EcK2 était fortement exprimé à la fois dans les MAG et dans les oreillettes d'A. gambiae, alors que l'EPP n'a été trouvé que dans les MAG. c, Analyse protéomique de l'éjaculome masculin transféré dans l'oreillette féminine à 3, 12 et 24 hpm, montrant les 67 protéines les plus abondantes. Les femelles ont été élevées avec de la nourriture contenant du 15N pour marquer (et masquer) toutes les protéines. Des mâles non marqués ont été accouplés avec des femelles marquées et les LRT femelles ont été disséquées à 3, 12 et 24 hpm pour une analyse protéomique (voir le tableau supplémentaire 1 pour une liste complète des protéines d'éjaculome). En médaillon, EPP, Eck1 et EcK2 détectés dans les MAG de mâles vierges par analyse protéomique de ces tissus. d, EPP détecté par western blot dans les MAG et les LRT femelles accouplées mais pas chez les femelles vierges ou dans le reste du corps des mâles ou des femelles. La membrane a été sondée simultanément avec des anticorps anti-actine (contrôle de charge) et anti-EPP. Tous les mâles étaient vierges. Pour les données de source de gel, voir la Fig. 1 supplémentaire. Le transfert Western a été effectué deux fois avec des résultats similaires.

Données source

L'activité ecdystéroïde phosphate phosphatase de l'EPP a été validée après incubation avec 3D20E22P isolé des MAG par HPLC – MS / MS (Extended Data Fig. 2a). De plus, lorsque nous avons réduit au silence l'EPP par interférence médiée par l'ARN (ARNi), nous avons détecté une forte diminution de l'activité de la phosphatase dans ces tissus reproducteurs mâles (Fig. 3a), et les femelles accouplées à des mâles silencieux en EPP ont montré une proportion significativement plus faible de 3D20E déphosphorylé. (Fig. 3b) malgré le silençage partiel du gène (Données étendues Fig. 2b, c). À l'inverse, nous n'avons pas détecté de changement significatif du rapport 20E22P / 20E chez les mêmes moustiques, suggérant peut-être une spécificité de cette enzyme pour 3D20E22P (Fig. 3b).

a, Diminution de l'activité de la phosphatase dans les MAG causée par le silençage de l'EPP à l'aide d'un contrôle d'ARN EPP double brin (dsEPP) ou d'ARN GFP double brin (dsGFP). Un pool de 20 MAG a été utilisé dans chaque répétition (P = 0,0046, test t apparié, bilatéral), indiqué par des points séparés. b, les femelles accouplées à des mâles silencieux EPP ont une proportion significativement plus faible de 3D20E déphosphorylé à 3 hpm (P = 0,0043, test t non apparié, bilatéral), alors que les niveaux de 20E ne sont pas affectés (P = 0,063, test t non apparié, bilatéral). Les données sont présentées sous forme de moyenne ± sem, dérivées de trois groupes de 13, 16 et 19 femelles chacun. c, les femelles accouplées à des mâles silencieux EPP ont un taux de réaccouplement significativement plus élevé (P = 0,0002, test exact de Fisher, bilatéral). Les femelles ont d'abord été accouplées de force pour assurer leur statut d'accouplement; 2 jours plus tard, ils ont été exposés à d'autres mâles porteurs de sperme transgénique pour évaluer les taux de réaccouplement par détection PCR quantitative du transgène. d, Les femelles nourries au sang accouplées à des mâles silencieux EPP ont une diminution significative de la fertilité (P < 0,0001 ; test de Mann-Whitney, bilatéral) et une légère diminution du nombre d'œufs (P = 0,088, test de Mann-Whitney, deux -face), alors que le taux de ponte n'est pas affecté (P = 0,94, test exact de Fisher, bilatéral). Dans tous les panels, n indique le nombre d'échantillons de moustiques biologiquement indépendants. NS, non significatif. *P < 0,05, **P < 0,01, ***P < 0,001, ****P < 0,001.

Données source

Nous avons ensuite évalué si la déphosphorylation des ecdystéroïdes est importante pour induire la réfractaire des femelles à l'accouplement. Remarquablement, les femelles se sont accouplées à des mâles appauvris en EPP à des fréquences nettement plus élevées (44, 9%) que les femelles témoins (10, 4%) lorsqu'elles sont exposées à des mâles supplémentaires (transgéniques) (Fig. 3c). Nous avons également observé une diminution significative de la fertilité (Fig. 3d, à gauche) et une diminution marginale du nombre d'œufs pondus par ces femelles (Fig. 3d, au centre), alors que le pourcentage de femelles pondant (une autre réponse déclenchée chez les femelles par l'accouplement ) n'a pas été affecté (Fig. 3d, à droite). Compte tenu de la spécificité observée de l'EPP pour 3D20E22P, ces résultats suggèrent que l'activation de 3D20E par l'EPP transféré pendant l'accouplement peut jouer un rôle prépondérant dans la désactivation de la réceptivité de la femelle à une copulation ultérieure, un comportement précédemment attribué au transfert sexuel de 20E. Par conséquent, cette hormone spécifique aux hommes affecte également fortement la fertilité féminine.

Nous avons ensuite comparé l'activité de 20E et de 3D20E dans des expériences d'injection chez des femelles vierges sexuellement matures, en utilisant du 3D20E synthétisé chimiquement (Fig. 4a – c) et du 20E disponible dans le commerce. Nous avons observé que 3D20E était significativement plus efficace que 20E pour désactiver la sensibilité de la femelle à l'accouplement à deux concentrations (Fig. 4d). Notamment, 24 h après les injections à la concentration la plus élevée, la moitié du niveau physiologique de 3D20E dans le LRT (1 066 pg après injections versus 2 022 pg après accouplement) induit une proportion de femelles réfractaires supérieure à 20 fois le niveau physiologique de 20E (361 pg après injections versus 18 pg après accouplement ; tableau de données étendu 1). Ce résultat est en accord avec la notion selon laquelle le transfert sexuel de 20E n'induit pas de réfractaire à l'accouplement et indique en outre que 3D20E est le principal facteur assurant la paternité. 3D20E a également montré une activité significativement plus élevée que 20E dans les tests de ponte chez les femelles vierges (Fig. 4e), ce qui suggère que les taux de ponte normaux que nous avons observés après un silence partiel de l'EPP étaient dus à des facteurs féminins encore déclenchés par l'accouplement en présence d'une activité résiduelle de 3D20E.

( a, b ) 3D20E synthétisé chimiquement à partir de 20E ( a ) avec des niveaux de conversion / efficacité très élevés (données présentées sous forme de moyenne ± sem, dérivées de trois réactions de synthèse indépendantes) ( b ). c, les spectres de masse (moitié inférieure) correspondaient parfaitement à ceux des ecdystéroïdes trouvés dans la LRT femelle accouplée (moitié supérieure). d, L'injection de 0,63 µg ou 0,21 µg 3D20E a induit une réfractaire à l'accouplement significativement plus élevée que 20E (0,63 µg, P = 0,02 ; 0,21 µg, P < 0,0001 ; tests exacts de Fisher, bilatéraux) et des contrôles d'éthanol à 10 % (0,63 µg, P < 0,0001 ; 0,21 µg, P < 0,0001 ; tests exacts de Fisher, bilatéraux), alors que 20E était significativement plus élevé que les témoins uniquement à la dose la plus élevée (0,63 µg, P = 0,0002 ; 0,21 µg, P = 0,54 ; tests exacts de Fisher , recto-verso). e, les injections de 3D20E ont induit des taux de ponte significativement plus élevés que les témoins à 10 % d'éthanol chez les femelles vierges (0,21 µg, P < 0,0001 ; 0,13 µg, P = 0,0003 ; tests exacts de Fisher, bilatéraux), alors que 20E était significatif par rapport aux témoins uniquement à la dose la plus élevée (0,21 µg, P = 0,022 ; 0,13 µg, P = 0,0823 ; tests exacts de Fisher, bilatéraux). 3D20E a induit des taux de ponte significativement plus élevés que 20E à des doses plus élevées (0,21 µg, P = 0,0019 ; 0,13 µg, P = 0,075 ; tests exacts de Fisher, bilatéraux). Dans tous les panels, n indique le nombre d'échantillons de moustiques biologiquement indépendants. NS, non significatif. *P < 0,05, **P < 0,01, ***P < 0,001, ****P < 0,001. Les données ont été regroupées à partir de trois répétitions.

Données source

Dans des études précédentes, nous avons déterminé que le transfert sexuel d'hormones stéroïdiennes induisait l'expression de MISO (stimulateur induit par l'accouplement de l'oogenèse11), un gène reproducteur féminin qui protège les femelles A. gambiae des coûts de remise en forme autrement infligés par une infection à Plasmodium falciparum13, le plus mortel parasite du paludisme humain. Compte tenu de l'importance du MISO pour la capacité de reproduction des anophèles dans les régions d'endémie palustre, nous avons décidé de déterminer quelle hormone, 3D20E ou 20E, déclenche l'expression de ce gène. Nous avons constaté qu'alors que les injections de 20E induisaient spécifiquement ou induisaient plus puissamment certains récepteurs hormonaux nucléaires (RH) tels que HR3 et HR4 et des cibles stéroïdiennes canoniques en aval telles que le gène de la vitellogenèse Vg14,15,16, le MISO était plus fortement induit par 3D20E (Extended Data figure 3). Le transfert sexuel de cette hormone stéroïde mâle semble donc induire des mécanismes qui protègent les femelles des coûts autrement infligés par une infection parasitaire. De plus, 3D20E a affecté de manière différentielle deux isoformes du récepteur E EcR, induisant EcR-A et réprimant EcR-B, et a déclenché plus fortement d'autres gènes induits par l'accouplement, notamment HPX15, qui affecte la fertilité féminine17. Cela pourrait expliquer l'infertilité significative observée chez les femelles accouplées à des mâles silencieux EPP (Extended Data Fig. 3). Ces données suggèrent l'existence de voies en aval préférentiellement activées par les deux ecdystéroïdes qui pourraient sous-tendre spécifiquement des fonctions spécifiques au sexe.

Nous avons ensuite testé la fonction des deux gènes EcK identifiés dans notre pipeline bioinformatique. Faire taire EcK1 ou EcK2 a induit une mortalité significative chez les mâles (données étendues Fig. 4a), montrant que la phosphorylation des ecdystéroïdes, et donc la désactivation12, est importante pour la survie. Étant donné que EcK2 est exprimé à des niveaux plus élevés que EcK1 et a été détecté dans les MAG par protéomique (Fig. 2b, c et tableau supplémentaire 2), nous avons validé son activité ecdystéroïde kinase en l'incubant avec 20E, ce qui a donné du 20E22P phosphorylé (Extended Data Fig. 4b). Lorsque 3D20E a été utilisé à la place comme substrat, nous n'avons pas pu détecter le produit de phosphorylation 3D20E22P (Extended Data Fig. 4c), ce qui indique que 20E plutôt que 3D20E peut être une cible préférée d'EcK2.

Selon notre analyse RNA-seq, EcK2 est également fortement exprimée dans le LRT des femelles vierges, où elle est désactivée après l'accouplement (Fig. 2b). Nous avons confirmé ces données et déterminé que l'expression d'EcK2 n'est pas affectée par l'alimentation sanguine (données étendues Fig. 5a). En élargissant nos expériences initiales sur la SP, nous avons déterminé que le pic de 20E22P reflétait étroitement celui de 20E (22 à 26 h après un repas de sang; Données étendues Fig. 5b). Le silence de EcK2 chez les femelles vierges a provoqué une multiplication par 3 du rapport relatif de 20E à 20E22P 26 h après un repas de sang (données étendues Figs. 2c et 5c), confirmant que EcK2 phosphoryle également 20E chez les femelles. Notamment, les vierges appauvries en EcK2 ont maintenu une réceptivité sexuelle complète (données étendues Fig. 5d, e), ce qui démontre en outre que le 20E produit par la femelle n'induit pas de réfractaire à l'accouplement. Cependant, ces femelles ont montré une augmentation significative des taux de ponte par rapport aux témoins, avec plus de 30% des vierges pondant des œufs (Extended Data Fig. 5f). La ponte n'a pas eu lieu si des injections d'ARN Eck2 double brin (dsEcK2) ont été effectuées après l'alimentation en sang, alors que le pic de 20E induit par l'ingestion de sang avait déjà diminué. Dans l'ensemble, ces résultats soutiennent un modèle selon lequel le 20E produit après l'alimentation sanguine peut induire la ponte, mais uniquement lorsque les blocs de ponte (EcK2 et éventuellement d'autres facteurs) sont désactivés par l'accouplement. Ni les injections 20E ni 3D20E n'ont supprimé l'expression d'EcK2 chez les vierges (données étendues Fig. 5g), ce qui indique que d'autres facteurs interviennent dans la répression de cette kinase. Cependant, les niveaux de 20E après l'alimentation sanguine ne sont pas suffisants pour induire une réfractaire à l'accouplement, qui est plutôt déclenchée efficacement par des titres élevés de 3D20E sexuellement transféré.

Nos résultats fournissent un aperçu critique des mécanismes régulant le succès reproducteur d'A. gambiae. Un modèle émerge dans lequel les mâles ont évolué pour synthétiser des titres élevés de 3D20E, un ecdystéroïde modifié spécifique aux mâles qui garantit la paternité en désensibilisant spécifiquement les femelles à un accouplement ultérieur. En parallèle, ces vecteurs du paludisme ont également développé un système efficace pour activer 3D20E chez les femmes basé sur le transfert sexuel d'EPP spécifique aux hommes. À notre connaissance, il s'agit du premier exemple d'un système d'hormones stéroïdes à prédominance mâle et femelle exerçant des fonctions distinctes et clés chez les insectes. L'existence de fonctions ecdystéroïdes spécifiques aux hommes a été postulée mais pas définitivement démontrée. Par exemple, une hypothèse largement réfutée18 est que de telles fonctions pourraient être assurées par le précurseur E1 de 20E. Il est bien établi que, chez la drosophile, la monandrie est plutôt déclenchée par le transfert sexuel de petits peptides sexuels19,20 qui interagissent avec les neurones innervant l'appareil reproducteur féminin via des récepteurs de peptides sexuels spécifiques21,22. Des travaux supplémentaires sont nécessaires pour identifier les cascades de signalisation en aval contrôlées par 3D20E chez les femelles A. gambiae et pour déterminer si ces cascades peuvent être conservées entre les moustiques et les mouches des fruits.

Compte tenu du rôle important de 3D20E pour la fertilité et le comportement des femelles déterminé dans notre étude, les voies menant à la synthèse et à l'activation de 3D20E offrent de nouvelles opportunités pour les futures stratégies de lutte contre les moustiques, telles que la génération de mâles stériles compétitifs pour les lâchers sur le terrain dans les stratégies de techniques d'insectes stériles23 ou l'imitation de 3D20E fonction chez les femelles vierges. Une fonction spécifique au mâle pour 3D20E peut avoir évolué lorsque A. gambiae et d'autres espèces de Cellia ont acquis la capacité de coaguler leur liquide séminal dans un bouchon d'accouplement, car cela permettait un transfert efficace de grandes quantités d'hormones et d'enzymes activant les hormones. À son tour, l'évolution de 3D20E pour imposer la monandrie a également équipé les femelles de mécanismes (grâce à l'expression élevée de MISO) favorisant leur capacité de reproduction dans les zones de forte endémicité palustre, ce qui favorise indirectement la propagation des parasites Plasmodium. Étant donné qu'il a été démontré que la femelle 20E affecte profondément la survie et la croissance de P. falciparum chez les femelles anophèles24, les voies des hormones stéroïdes mâles et femelles sont désormais des facettes clés des interactions moustiques-parasites.

La souche A. gambiae G3 a été élevée dans des conditions d'insectarium standard (26–28 °C, 65–80 % d'humidité relative, 12 h 12 photopériode lumière/obscurité). Les larves ont été nourries avec de la nourriture en poudre pour poissons (TetraMin Tropical Flakes, Koi Pellets et Tetra Pond Sticks dans un rapport de 7:7:2). Les moustiques adultes ont été nourris ad libitum avec une solution de glucose à 10 % et une fois par semaine avec du sang humain (Research Blood Components). Des moustiques vierges ont été obtenus en séparant les sexes au stade nymphal après examen microscopique des terminalia. Des mâles porteurs du transgène DsRed ont déjà été décrits25.

Des expériences d'accouplement forcé ont été menées selon les protocoles décrits précédemment13. Pour l'accouplement naturel, des femelles vierges de 4 jours ont été gardées pendant deux nuits avec des mâles vierges sexuellement matures dans un rapport de 1:3. Pour les expériences utilisant des mâles ayant reçu une injection de dsEPP, la co-cage a coïncidé avec les jours 3 à 4 après l'injection, lorsque l'activité de la phosphatase a été réduite au silence au maximum (Extended Data Fig. 2b).

Les tissus de moustiques, les carcasses restantes (reste du corps) ou les corps entiers ont été disséqués dans du méthanol à 100 % et homogénéisés avec un batteur à billes (billes de verre de 2 mm, 2 400 tr/min, 90 s). Le nombre de tissus et le volume de méthanol étaient les suivants : reste du corps, 50 dans 1 000 µl ; MAG, 50 à 100 dans 80 µl ; LRT femelle, 25–50 dans 80 µl. L'extraction au méthanol a été effectuée une deuxième fois sur le culot en utilisant le même volume de méthanol. Les débris cellulaires ont été éliminés par centrifugation. Le méthanol de deux extractions a été combiné et séché sous flux d'azote et remis en suspension dans les volumes suivants de méthanol à 80 % dans de l'eau : reste du corps, 50 ul ; MAG et LRT femelle, 30 µl.

Les échantillons ont été analysés sur un spectromètre de masse (ID-X, Thermo Fisher) couplé à un instrument LC (Vanquish, Thermo Fisher). Cinq microlitres d'échantillon ont été injectés sur une colonne de 3 µm, 100 × 4,6 mm (Inspire C8, Dikma) maintenue à 25 °C. Les phases mobiles pour la LC étaient A (eau, 0,1 % d'acide formique) et B (acétonitrile, 0,1 % d'acide formique). Le gradient LC était le suivant : 1 min à 5 % B suivi d'une augmentation à 100 % B en 11 min. Après 8 min à 100%, la colonne a été rééquilibrée à 5% B pendant 4 min. Le débit était de 0,3 ml min-1. L'ionisation dans la source MS a été réalisée par ionisation électrospray chauffée en modes positif et négatif.

Le spectromètre de masse a mesuré les données en mode full-MS à une résolution de 60 000 sur une plage m/z de 350 à 680. Les données MS/MS ont été acquises sur [M + H]+ (toutes les cibles), [M − H2O + H] + (toutes cibles) et [M − H]− (cibles phosphorylées). Les données MS/MS ont été utilisées pour confirmer la nature ecdystéroïde des cibles pour lesquelles aucun étalon n'était disponible. Pour identifier les ecdystéroïdes non ciblés, les données MS/MS pour tous les pics HPLC d'abondance relative > 15 % ont été analysées. La quantification a été effectuée à l'aide de courbes standard créées à partir de standards purs (20E, 3D20E) pour calculer les quantités absolues ou les dilutions d'un échantillon spécifique (toutes les autres cibles) pour calculer leur équivalence à la quantité trouvée chez un mâle. Pour 3D20E, la quantification a été réalisée avec la somme des adduits suivants : [M + TFA]-, [M + COOH]-, [M + Na]+, [M + Cl]-, [M + NO3]-. Les données ont été extraites et quantifiées à l'aide de Tracefinder (version 4.1). Les données MS/MS ont été analysées à l'aide de Xcalibur (version 4.4). Les spectres MS de E, 20E et 3D20E ont été comparés aux normes respectives. 3D20E22P a été analysé par dérivatisation avec le réactif de Girard. 20E22P a été analysé par rapport m/z.

3D20E22P a été purifié à partir de MAG. La purification a été réalisée à l'échelle analytique dans les mêmes conditions LC que pour l'analyse HPLC-MS/MS à l'aide d'un instrument de chromatographie liquide ultra-performante (Acquity, Waters) couplé à un détecteur quadripolaire basé sur la masse (QDa, Acquity, Waters). La collecte de fractions a été déclenchée lorsque le m/z correspondant à 3D20E22P a été détecté au même temps de rétention que celui précédemment identifié. La pureté des composés extraits a ensuite été vérifiée par HPLC-MS/MS comme décrit ci-dessus.

L'ARN total a été extrait avec le réactif TRI (Thermo Fisher) à partir de pools de 10 à 12 tissus reproducteurs ou du reste du corps (sans tête) en suivant les instructions du fabricant. L'ARN a été traité avec TURBO DNase (Thermo Fisher). L'ADNc a été synthétisé en utilisant la transcriptase inverse du virus de la leucémie murine de Moloney (M-MLV RT; Thermo Fisher) en suivant les instructions du fabricant. Les amorces utilisées pour la PCR quantitative avec transcription inverse (RT-qPCR ; Extended Data Table 2) ont été précédemment publiées24 ou ont été conçues à l'aide de Primer-BLAST26 avec des préférences pour les produits de 70 à 150 pb et pour les amorces couvrant les jonctions exon-exon ou les paires d'amorces sur exons séparés. Les échantillons d'ADNc de trois à quatre réplicats biologiques ont été dilués quatre fois dans de l'eau pour la RT-qPCR. La quantification a été effectuée dans des réactions dupliquées de 15 µl contenant 1 × PowerUp SYBR Green Master Mix (Thermo Fisher), des amorces et 5 µl d'ADNc dilué. Les réactions ont été exécutées sur un système de PCR en temps réel QuantStudio 6 Pro (Thermo Fisher), et les données ont été collectées et analysées à l'aide de Design and Analysis (version 2.4.3). Les quantités relatives ont été normalisées par rapport au gène ribosomal RpL19 (AGAP004422), dont l'expression ne change pas significativement avec l'alimentation sanguine27 ou l'accouplement3, comme le confirme cette étude.

La qualité de l'ARN a été vérifiée avec un bioanalyseur Agilent 2100 Bioanalyzer (Agilent). Les bibliothèques d'extrémités appariées Illumina ont été préparées et exécutées au Broad Institute du MIT et de Harvard. Les lectures de séquençage ont été alignées sur le génome d'A. gambiae (souche PEST, version 4.12) à l'aide de HISAT2 (version 2.0.5) avec les paramètres par défaut. Les lectures avec des scores de qualité de cartographie (MAPQ) <30 ont été supprimées à l'aide de Samtools (version 1.3.1). Le nombre de lectures mappées sur les gènes a été compté à l'aide de htseq-count (version 0.9.1) avec les paramètres par défaut. Le calcul du nombre de lectures normalisées et l'analyse de l'expression différentielle des gènes ont été effectués à l'aide du package DESeq2 (version 1.28.1) dans R (version 4.0.3).

Les gènes candidats modificateurs d'ecdystéroïdes ont été identifiés en recherchant d'abord le génome d'A. gambiae avec l'algorithme PSI-BLAST (https://ftp.ncbi.nlm.nih.gov/blast/executables/blast+/2.8.1/) en utilisant la valeur par défaut paramètres avec les séquences de protéines de requête suivantes : EcK de Bombyx mori (accession NP_001038956.1), Musca domestica (accessions XP_005182020.1, XP_005175332.1 et XP_011294434.1) et Microplitis demolitor (accessions XP_008552646.1 et XP_008552645. 1); EPP de B. mori (accession NP_001036900), Drosophila melanogaster (accession NP_651202), Apis mellifera (accession XP_394838) et Acyrthosiphon pisum (accession : XP_001947166) ; et EO de B. mori (accessions NP_001177919.1 et NP_001243996.1) et D. melanogaster (accession NP_572986.1) (étape 1). Ensuite, les gènes touchés ont été filtrés sur la base de l'expression élevée de l'ARNm (> 100 fragments par kilobase d'exon par million de lectures cartographiées (FPKM) ou> 85e centile) dans les tissus reproducteurs (LRT ou MAG femelles) d'A. gambiae (étape 2) . Pour une meilleure spécificité, nous avons sélectionné des enzymes candidates également exprimées dans les tissus reproducteurs d'A. albimanus, une espèce d'anophèle qui ne synthétise ni ne transfère d'ecdystéroïdes pendant l'accouplement7 ; les gènes candidats ont été filtrés sur la base d'une faible expression (<100 FPKM ou <85e centile) dans les tissus reproducteurs d'A. albimanus (étape 3). En tant que filtre final (étape 4), les gènes candidats devaient satisfaire au moins l'un des éléments suivants : (1) une régulation à la hausse significative après l'accouplement (P <0,05) selon l'analyse des gènes exprimés de manière différentielle et (2) l'absence d'expression chez les non -tissus reproducteurs (<85e centile ou <100 FPKM).

Nous avons modifié une méthode28,29,30 décrite précédemment pour obtenir un marquage isotopique de l'organisme entier. En bref, le type sauvage de Saccharomyces cerevisiae type II (YSC2, Sigma) a été cultivé dans un milieu contenant (wt/vol) 2 % de glucose (G7528, Sigma), 1,7 % de base azotée de levure sans acides aminés et sulfate d'ammonium (BD Difco, DF0335 ) et 5 % de sulfate d'ammonium 15 N (NLM-713, > 99 %, Cambridge Isotope Laboratories) comme seule source d'azote. La levure a été récupérée par centrifugation et donnée ad libitum aux larves de moustiques jusqu'à la nymphose. De la nourriture en poudre pour poisson a été complétée (0,5 mg pour 300 larves) pour prévenir la mort au quatrième stade. Seules les femelles ont ensuite été utilisées dans des expériences d'accouplement avec des mâles non marqués pour analyser le protéome mâle transféré lors de la copulation.

Des femelles vierges marquées au 15N âgées de 4 à 6 jours ont été accouplées de force avec des mâles vierges non marqués du même âge. L'accouplement réussi a été vérifié par la détection d'un bouchon d'accouplement sous un microscope à épifluorescence. À 3, 12 et 24 hpm, les oreillettes de 45 à 55 femelles accouplées ont été disséquées dans 50 µl de tampon de bicarbonate d'ammonium (pH 7,8) et homogénéisées avec un pilon. L'homogénat a été centrifugé et le surnageant a été combiné avec 50 ul de RapiGest à 0,1 % (186001860, Waters) dans du bicarbonate d'ammonium 50 mM. Le surnageant et le culot de chaque échantillon ont été congelés instantanément sur de la neige carbonique et expédiés pendant la nuit au laboratoire MacCoss de l'Université de Washington, où la préparation des échantillons pour LC-MS/MS a été terminée. Les culots ont été remis en suspension dans 50 ul de RapiGest à 0,1 % dans du bicarbonate d'ammonium 50 mM et soniqués dans un bain-marie. La concentration en protéines a été mesurée pour les culots et les surnageants par dosage BCA, et les échantillons ont été réduits avec du dithiothréiotol 5 mM (DTT; Sigma) alkylé avec de l'iodoacétamide 15 mM (Sigma) et digérés avec de la trypsine pendant 1 h à 37 ° C (1: 50 rapport trypsine:substrat). RapiGest a été clivé avec l'ajout de HCl 200 mM suivi de 45 min d'incubation à 37 ° C et de centrifugation à 14 000 tr/min pendant 10 min à 4 ° C pour éliminer les débris. Les échantillons ont été nettoyés par extraction en phase solide à double mode (cartouches Oasis MCX, Waters) et remis en suspension dans de l'acide formique à 0,1 % à une concentration finale en protéines de 0,33 µg µl−1. Les protéomes MAG non marqués ont été analysés de la même manière à partir de mâles vierges. Deux réplicats analytiques ont été analysés pour chaque échantillon. Ensuite, 1 µg de chaque digestion d'échantillon a été analysé à l'aide d'une colonne de 75 µm de silice fondue de 25 cm et d'un piège à fritte de silice fondue Kasil1 (PQ) de 4 cm chargé avec de la résine en phase inverse Jupiter C12 (Phenomenex) avec un LC de 180 minutes. –MS/MS exécuté sur un spectromètre de masse Q-Exactive HF (Thermo Fisher) couplé à un système nanoACQUITY UPLC (Waters). Les données d'acquisition dépendantes des données générées à partir de chaque exécution ont été converties au format mzML à l'aide de Proteowizard (version 3.0.20287) et ont été recherchées à l'aide de Comet31 (version 3.2) par rapport à une base de données FASTA contenant des séquences de protéines de A. gambiae (VectorBase release 54), Anopheles coluzzi Mali-NIH (VectorBase version 54), S. cerevisiae (Uniprot, mars 2021), traductions à trois cadres de A. gambiae RNA-seq et contaminants humains connus. Les FDR correspondant au spectre des peptides ont été déterminés à l'aide de Percolator32 (version 3.05) à un seuil de 0,01, et les peptides ont été assemblés en identifications de protéines à l'aide de la parcimonie des protéines dans Limelight33 (version 2.2.0). L'abondance relative des protéines a été estimée à l'aide d'un facteur d'abondance spectrale normalisé (NSAF) calculé pour chaque protéine dans chaque cycle, comme décrit précédemment28. Le NSAF par rapport à chaque protéine a été moyenné sur des échantillons provenant de deux réplicats biologiques différents. Le marquage au 15N a masqué avec succès le protéome femelle, bien qu'un petit nombre de protéines non marquées aient pu être détectées à partir de vierges marquées. Nous avons documenté la détection à des quantités réduites (1 à 5 spectres) de protéines mâles dans des échantillons vierges femelles uniquement dans des essais techniques dans lesquels les échantillons vierges ont été exécutés après des échantillons mâles/accouplés, à la suite du « carryover » HPLC. Les protéines qui ont parfois été trouvées en tant que « contaminants » provenant de vierges étiquetées sont répertoriées dans le tableau supplémentaire 1.

Deux peptides antigéniques, QTTDRVAPAPDQQQ (dans l'isoforme PA) et MESDGTTPSGDSEQ (dans les deux isoformes PA et PB), de la séquence de la protéine EPP ont été identifiés sur la base des prédictions d'antigénicité, de probabilité d'exposition à la surface et d'hydrophilie fournies dans le cadre du service d'anticorps personnalisé chez Genscript. Les deux peptides ont été regroupés puis conjugués avec la protéine porteuse KLH et injectés à des lapins néo-zélandais. Les lapins ont été sacrifiés après la quatrième injection et l'IgG totale a été isolée par purification par affinité. L'IgG du lapin le plus spécifique à l'EPP a été utilisée dans un Western blot supplémentaire.

Pour le Western Blot, les MAG (n = 10, où n indique le nombre d'échantillons de moustiques biologiquement indépendants) et les LRT femelles (n = 30) ont été disséqués à partir de mâles vierges de 4 jours et de femelles vierges ou accouplées de force (<10 min après accouplement), respectivement, dans un tampon d'extraction de protéines (Tris 50 mM, pH 8,0 ; NP-40 1 % ; désoxycholate de sodium 0,25 % ; NaCl 150 mM ; EDTA 1 mM ; mélange d'inhibiteurs de protéase 1 x (Roche)). Les échantillons ont été immédiatement homogénéisés après dissection avec un batteur à billes (billes de verre de 2 mm, 2 400 tr/min, 90 s). Les débris insolubles ont été éliminés par centrifugation à 20 000 g à 4 °C. La protéine a été quantifiée par le test de Bradford (Bio-Rad). Ensuite, 20 µg de protéine MAG, 40 µg de protéine LRT et 20 µg de protéine restante du corps ont été dénaturés et séparés par 10% Bis – Tris NuPAGE en utilisant un tampon MOPS. La protéine a été transférée sur une membrane de difluorure de polyvinylidène en utilisant un système de transfert iBlot2 (Thermo Fisher). Les membranes ont été lavées deux fois dans du PBS-T 1X (0,1 % de Tween-20 dans du PBS) et ont ensuite été bloquées pendant 1 h à 22 °C dans du tampon de blocage Odyssey (Li-Cor). Les membranes ont été incubées avec l'anticorps primaire polyclonal anti-EPP de lapin personnalisé (1: 700 dans un tampon de blocage) et l'anticorps primaire monoclonal anti-actine de rat MAC237 (Abcam; 1: 4 000) sous agitation pendant une nuit à 4 ° C. Les membranes ont été lavées avec du PBS-T puis incubées avec des anticorps secondaires (âne anti-lapin 800CW et chèvre anti-rat 680LT (Li-Cor), tous deux à 1:20 000) dans un tampon de blocage avec 0,01 % de SDS et 0,2 % de Tween -20 pendant 1 h à 22 °C. Les membranes ont été lavées avec du PBS-T et imagées avec un scanner Odyssey CLx. Les images ont été collectées et traitées dans Image Studio (version 5.2). Aucune bande spécifique correspondant à l'isoforme EPP-RA (82 kDa) n'a été détectée.

Les régions codantes de EPP (sous forme d'isoforme AGAP002463-RB contenant le domaine histidine phosphatase, NCBI Conserved Domain Search34) et EcK2 (AGAP002181) ont été clonées dans le plasmide pET-21a(+) (Novagen Millipore Sigma) ; les amorces sont répertoriées dans le tableau de données étendu 2. Huit lieurs GS4 (en tandem) ont été insérés avant l'étiquette 6 × His C-terminale dans la construction pET-21a (+) -EcK2. Des protéines recombinantes ont été produites avec des réactions de synthèse de protéines d'Escherichia coli sans cellules NEBExpress (New England BioLabs). Les protéines recombinantes ont été purifiées avec des colonnes de centrifugation NEBExpress Ni (New England BioLabs). La protéine de contrôle de la dihydrofolate réductase (DHFR) a été produite à l'aide de la matrice d'ADN du kit de synthèse de protéines d'E. coli sans cellules NEBExpress. Les protéines ont été stockées dans du glycérol à 50% dans du PBS à -20 ° C pendant 3 mois maximum.

L'activité phosphatase de l'EPP et des extraits de tissus a été mesurée à l'aide de 4-nitrophényl phosphate (pNPP; Sigma-Aldrich). Le tampon de réaction contenait du Tris 25 mM, de l'acide acétique 50 mM, du Bis-Tris 25 mM, du NaCl 150 mM, de l'EDTA 0,1 mM et du DTT 1 mM. Les tissus ont été homogénéisés dans un tampon de réaction et les débris cellulaires ont été éliminés par centrifugation. La réaction a été initiée en ajoutant une enzyme ou un extrait tissulaire au tampon de réaction contenant 2,5 mg ml-1 de pNPP. Le mélange réactionnel a été incubé à température ambiante dans l'obscurité, et la quantité de pNP convertie à partir de pNPP a été quantifiée en mesurant l'absorption à 405 nm à différents moments.

Pour l'activité EcK in vitro, les protéines ont été incubées avec 0,2 mg de 20E ou 3D20E dans 200 µl de tampon (pH 7,5) contenant 10 mM HEPES-NaOH, 0,1 % BSA, 2 mM ATP et 10 mM MgCl2 à 27 °C pendant 2 h . La réaction a été terminée en ajoutant 800 µl de méthanol et a ensuite été refroidie pendant 1 h à -20 °C, puis centrifugée à 20 000 g pendant 10 min à 4 °C. Le surnageant a ensuite été analysé par HPLC-MS/MS. Pour inactiver à la chaleur les protéines utilisées dans les groupes témoins, les protéines ont été incubées à 95 ° C pendant 20 min dans du glycérol à 50 % dans du PBS.

Pour l'activité EPP in vitro, les protéines ont été incubées avec 3D20E22P (équivalent à la quantité trouvée dans 18 paires de MAG, purifiées par HPLC–MS/MS) dans 100 µl de tampon (pH 7,5) contenant du Tris 25 mM, de l'acide acétique 50 mM, Bis-Tris 25 mM, NaCl 150 mM, EDTA 0,1 mM et DTT 1 mM à 27 ° C pendant 3 h. La réaction a été arrêtée en ajoutant 400 µl de méthanol et a été refroidie pendant 1 h à -20 °C, puis centrifugée à 20 000 g pendant 10 min à 4 °C. Le surnageant a été analysé par HPLC-MS/MS.

Des fragments PCR d'EPP (362 bp), EcK1 (AGAP004574, 365 bp) et EcK2 (556 bp) ont été amplifiés à partir d'ADNc préparé à partir de carcasses de moustiques sans tête de sexe mixte. Un fragment PCR du contrôle eGFP (495 pb) a été amplifié à partir de pCR2.1-eGFP décrit précédemment11 ; les amorces de PCR sont répertoriées dans le tableau de données étendu 2. Des fragments de PCR ont été insérés entre les promoteurs T7 inversés sur le plasmide pL4440. Les constructions plasmidiques ont été récupérées à partir de NEB 5-alpha Competent E. coli (New England Biolabs) et ont été vérifiées par séquençage d'ADN avant utilisation (voir Données supplémentaires 1 pour les séquences d'insertion). Une amorce correspondant au promoteur T7 (tableau de données étendu 2) a été utilisée pour amplifier les inserts à partir de plasmides à base de pL4440. Les tailles des produits de PCR ont été confirmées par électrophorèse sur gel d'agarose. L'ARNdb a été transcrit à partir des matrices PCR à l'aide du kit de transcription Megascript T7 (Thermo Fisher) et a été purifié en suivant les instructions du fabricant avec les modifications décrites précédemment35.

Pour l'injection d'ARNdb, 1 380 ng d'ARNdb (dsGFP, dsEcK1, dsEcK2, dsEPP) ont été injectés (Nanoject III, Drummond) à une concentration de 10 ng nl-1 dans le thorax d'hommes ou de femmes adultes dans la journée suivant l'éclosion. Les niveaux d'inactivation des gènes ont été déterminés dans au moins trois réplicats biologiques par extraction d'ARN, synthèse d'ADNc et RT-qPCR. Pour les injections d'ecdystéroïdes, selon le dispositif expérimental, des femelles vierges de 4 jours ou de 6 jours nourries de sang ont été injectées (Nanoject III, Drummond) avec 0,13, 0,21 ou 0,63 µg de 20E ou 3D20E à une concentration de 1,3, 2,1 ou 6,3 ng nl−1, respectivement. Dix pour cent (vol/vol) d'éthanol dans l'eau ont été injectés à un volume de 100 nl ; 3D20E22P dans 10% d'éthanol a été injecté à un volume de 100 nl (équivalent à 75% de la quantité trouvée dans une paire de MAG). Les moustiques ont été assignés au hasard à des groupes d'injection.

Pour les tests de ponte, des femelles âgées de 3 jours ont été nourries à volonté sur du sang humain. Les moustiques partiellement nourris ou non ont été éliminés. Selon le traitement, après un minimum de 48 h après le repas sanguin, les femelles ont été placées dans des coupelles de ponte individuelles pendant quatre nuits. Les œufs ont été comptés sous un stéréoscope (Stemi 508, Zeiss); pour les femelles accouplées, les œufs qui ont éclos en larves ont été classés comme fertiles.

Pour les tests d'accouplement, selon le traitement, les femelles ont eu un minimum de 2 jours pour développer une réfractaire à l'accouplement, et des mâles de type sauvage appariés selon l'âge ont ensuite été introduits dans la même cage. Après deux nuits, les spermathèques des femelles ont été disséquées et l'ADN génomique a été libéré par congélation-décongélation et sonication dans un tampon contenant du Tris-HCl 10 mM, de l'EDTA 1 mM et du NaCl 25 mM (pH 8,2). Les échantillons ont été incubés avec de la protéinase K (0,86 µg µl-1) pendant 15 min à 55 °C suivis de 10 min à 95 °C. La préparation d'ADN génomique brut a été diluée 10 fois et a été soumise à la détection qPCR d'une séquence du chromosome Y ; les amorces sont répertoriées dans le tableau de données étendu 2. L'absence d'une séquence du chromosome Y indique qu'il n'y a pas d'accouplement.

Pour les tests de réaccouplement, les femelles accouplées de force ont été vérifiées pour la présence de bouchons d'accouplement pour confirmer le statut d'accouplement et ont été autorisées 2 jours à développer une réfractaire à l'accouplement en l'absence de mâles, comme décrit précédemment36. Des mâles porteurs de sperme transgénique DsRed ont ensuite été introduits dans des cages pour femelles. Après deux nuits, les spermathèques ont été disséquées des femelles, et l'ADN génomique a été préparé comme décrit ci-dessus et soumis à la détection qPCR du transgène DsRed ; les amorces sont répertoriées dans le tableau de données étendu 2. L'absence du transgène DsRed indique l'absence de réaccouplement.

3D20E a été synthétisé comme décrit précédemment37. En bref, 10 mg de 20E (Sigma-Aldrich) ont été dissous dans 10 ml d'eau, puis 30 mg de noir de platine (sous forme de poudre, Sigma-Aldrich) ont été ajoutés. Un léger courant de gaz O2 a barboté en continu dans le mélange réactionnel, qui a été agité à température ambiante. Au bout de 6 h, la réaction est terminée par addition de 30 ml de méthanol. Le mélange a été centrifugé et le culot de catalyseur a été retiré. Le surnageant est évaporé à sec sous vide à température ambiante. Le produit de réaction séché a été dissous dans 10 % d'éthanol pour injection et de méthanol pour l'analyse HPLC-MS/MS. Le taux de conversion (de 20E à 3D20E) était d'environ 97% (Fig. 4b) et les spectres MS du 3D20E synthétisé correspondaient à ceux de 3D20E trouvés chez les femelles accouplées (Fig. 4c).

Les légendes des figures contiennent des détails spécifiques sur les tests statistiques effectués. GraphPad (version 9.0) a été utilisé pour effectuer les tests exacts de Fisher, les tests de Mantel-Cox et les tests t de Student. Les tests Cochran – Mantel – Haenszel ont été effectués à l'aide d'un script R personnalisé (disponible sur https://github.com/duopeng/mantelhaen.test). La normalité de la distribution des données a été testée avec le test de Shapiro-Wilk en utilisant un seuil de signification de 0,05. Les tests de Mann-Whitney ont été effectués lorsque les données ne réussissaient pas le test de normalité. Les données de survie ont été analysées avec le test de Mantel-Cox. Le package DESeq2 (version 1.28.1) a été utilisé pour effectuer une analyse d'expression différentielle au niveau du gène RNA-seq. Les barres horizontales sur les graphiques représentent les médianes. Une valeur de signification de P = 0,05 a été utilisée comme seuil dans tous les tests.

De plus amples informations sur la conception de la recherche sont disponibles dans le résumé des rapports de recherche sur la nature lié à cet article.

Tous les western blots originaux sont fournis dans les informations supplémentaires.

Les données sur le protéome MS ont été déposées auprès du Consortium ProteomeXchange (http://proteomecentral.proteomexchange.org) via le référentiel partenaire PRIDE (https://www.ebi.ac.uk/pride/) avec l'identifiant d'ensemble de données PXD032157.

Les ensembles de données RNA-seq ont été déposés dans le référentiel Gene Expression Omnibus (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/) sous l'enregistrement de série GSE198665.

D'autres ensembles de données générés pendant et/ou analysés pendant l'étude en cours sont disponibles auprès de l'auteur correspondant sur demande raisonnable. Les données sources sont fournies avec ce document.

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Nous remercions E. Nelson, K. Thornburg et E. Selland pour leur aide à l'élevage des moustiques et les membres du laboratoire Catteruccia pour leurs commentaires sur le manuscrit. Le financement de cette étude a été fourni par le Howard Hughes Medical Institute and Bill and Melinda Gates Foundation (BMGF) Faculty Scholars Award (subvention ID OPP1158190) et par les National Institutes of Health (NIH) (numéros de prix R01 AI104956 et R01 AI124165) pour Le travail de FC Proteomics a été soutenu par le NIH (P41 GM103533) à MJM Le travail de séquençage d'ARN a été soutenu par la Harvard Data Science Initiative (Postdoctoral Fellow Research Fund, 2019) à DP reflètent nécessairement les positions ou les politiques du HHMI, du BMGF ou du NIH. FC est un enquêteur HHMI.

Evdoxia G. Kakani et Sara N. Mitchell

Adresse actuelle : Verily Life Sciences, South San Francisco, Californie, États-Unis

Enzo Mameli

Adresse actuelle : Department of Genetics, Blavatnik Institute, Harvard Medical School, Boston, MA, États-Unis

Département d'immunologie et des maladies infectieuses, Harvard TH Chan School of Public Health, Boston, MA, États-Unis

Duo Peng, Evdoxia G. Kakani, Enzo Mameli, Sara N. Mitchell, Kelsey Adams, Tasneem A. Rinvee, W. Robert Shaw et Flaminia Catteruccia

Harvard Center for Mass Spectrometry, Cambridge, MA, États-Unis

Charles Vidoudez

Département des sciences du génome, Université de Washington, Seattle, WA, États-Unis

Gennifer E. Merrihew et Michael J. MacCoss

Institut médical Howard Hughes, Chevy Chase, MD, États-Unis

Flaminia Catteruccia

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DP, EGK, SNM, WRS et FC ont conçu l'étude, conçu des expériences et interprété les données. DP, EGK, SNM, KA et TAR ont effectué des essais d'accouplement. CV a effectué des analyses par spectrométrie de masse des ecdystéroïdes. EGK et SNM ont effectué la collecte d'échantillons d'ARN-seq et la préparation de la bibliothèque. DP, EGK et SNM ont analysé les données RNA-seq. DP a construit le pipeline bioinformatique personnalisé. EM a effectué le marquage isotopique de l'organisme entier et la collecte d'échantillons de protéomes. GEM et MJM ont effectué une analyse par spectrométrie de masse du protéome. DP a effectué des transferts Western et a coordonné la production de l'anticorps personnalisé. DP, EGK, SNM et TAR ont effectué le silençage de l'ARNdb, l'analyse de l'expression génique RT – qPCR, les tests de ponte et les tests de réaccouplement. DP et TAR ont effectué des tests de mortalité. DP a effectué une synthèse chimique, exprimé et purifié des protéines recombinantes et effectué des tests enzymatiques. DP, WRS et FC ont rédigé le document. FC a supervisé l'étude.

Correspondance à Flaminia Catteruccia.

Les auteurs ne déclarent aucun intérêt concurrent.

Nature remercie Michael O'Connor et les autres examinateurs anonymes pour leur contribution à l'examen par les pairs de ce travail. Les rapports des pairs examinateurs sont disponibles.

Note de l'éditeur Springer Nature reste neutre en ce qui concerne les revendications juridictionnelles dans les cartes publiées et les affiliations institutionnelles.

3D20E et 3D20E22P ne sont pas détectés chez (a) les femelles vierges nourries de sang et (b, à gauche) les femelles nouvellement écloses (dans le 1 jour suivant l'éclosion), mais sont spécifiquement détectés dans (b, à droite) les glandes accessoires (MAG) des -les mâles enfermés. E, 20E et 20E22P sont détectés à différents niveaux dans la plupart des échantillons. Dans tous les panels : les données sont présentées sous forme de moyennes ± sem dérivées de trois réplicats biologiques (pbm = post-repas de sang)

Données source

( a ) Représentation schématique de la réaction qui devrait être catalysée par l'EPP transféré sexuellement dans l'oreillette femelle accouplée. La ligne pointillée met en évidence la fraction phosphate ciblée par EPP. L'EPP recombinant (rEPP) catalyse la déphosphorylation de 3D20E22P in vitro. En utilisant 3D20E22P (extrait des MAG par HPLC-MS/MS) comme substrat, HPLC-MS/MS a été utilisé pour détecter la production de 3D20E après incubation avec l'enzyme recombinante. DHFR : dihydrofolate réductase, utilisée comme témoin négatif ; HI : rEPP inactivé par la chaleur, utilisé comme deuxième contrôle négatif. Les données sont présentées sous forme de moyennes ± sem dérivées de trois répétitions d'essais in vitro. ( b ) Analyse temporelle de l'expression de l'EPP (rouge) et de l'activité de la phosphatase (violet) dans les MAG par rapport au dsGFP au jour 0 (moyenne ± sem). Les taux d'EPP étaient les plus bas deux jours après l'injection (dpi) et l'activité de la phosphatase était la plus faible à 3–4 dpi. Les données ont été regroupées à partir de trois répétitions. ( c ) Efficacités de silençage RT-qPCR pour les injections d'ARNdb, normalisées au gène ribosomique domestique RpL19 et calculées comme l'expression du gène cible par rapport au contrôle GFP (moyenne ± sem). Les données ont été regroupées à partir de trois répétitions.

Données source

Les injections de 3D20E (0,63 µg) induisent une expression significativement plus forte de MISO par rapport à la même quantité de 20E. Les injections 3D20E activent également spécifiquement ou plus puissamment l'expression de l'isoforme EcR A (EcR-A) et des gènes induits par l'accouplement AGAP006421, AGAP004263 et HPX15, alors qu'ils répriment l'isoforme EcR EcR-B. Les injections de 20E activent spécifiquement le gène de la protéine jaune Vg et HR4, et induisent plus puissamment l'expression de HR3 (les données sont présentées sous forme de moyennes ± sem dérivées de trois réplicats biologiques de pools de 10 moustiques chacun (les données HR4 provenaient de quatre relications biologiques de pools de 10 moustiques chacun), des tests t non appariés, bilatéraux et corrigés par FDR ont été effectués pour les comparaisons 20E vs 3D20E ; la signification statistique au-dessus de chaque barre indique la comparaison avec l'injection d'EtOH à 10 % : test t non apparié, bilatéral). Voir le tableau supplémentaire 3 pour les valeurs P

Données source

( a ) La survie des mâles est affectée négativement par le silence de EcK1 et EcK2 mais pas de EPP. Le taux de survie est significativement réduit chez les mâles silencieux EcK1 (à gauche) et les mâles silencieux Eck2 (au milieu), mais pas chez les mâles silencieux EPP (droite) par rapport aux témoins dsGFP (signifie ± sem, n indique le nombre d'échantillons de moustiques biologiquement indépendants , test de Mantel-Cox, bilatéral). (b – c) EcK2 recombinant (rEcK2) phosphoryle efficacement (b) 20E mais pas (c) 3D20E, comme déterminé par HPLC-MS/MS. Les moyennes ± sem ont été dérivées de trois répétitions d'essais in vitro. Les témoins négatifs (DHFR et inactivés par la chaleur, HI, rEcK2) ne phosphorylent pas 20E ou 3D20E. Des représentations schématiques des réactions catalysées par EcK2 sont fournies

Données source

(a) L'expression d'EcK2 est élevée dans le tractus reproducteur inférieur (LRT) des femelles vierges et est supprimée après l'accouplement. L'alimentation sanguine n'affecte pas l'expression d'EcK2 à différents moments après le repas de sang (pbm) (0 h : P = 0,024, 3 h : P = 0,031, 24 h : P = 0,029, signifie ± sem, test t non apparié, un- côtés). (b) 20E22P est détecté dans le LRT de femelles vierges après un repas de sang (signifie ± sem). La quantification a été réalisée par HPLC-MS/MS. Les lignes pointillées relient les valeurs moyennes du même ecdystéroïde à différents moments. ( c ) Le silence EcK2 avant l'alimentation en sang augmente de manière significative le rapport de 20E vs 20E22P à 26 pbm dans le LRT de femelles vierges (P = 0, 047, signifie ± sem, test t non apparié, unilatéral). ( d ) La réceptivité à l'accouplement (évaluée par la présence d'un bouchon d'accouplement) chez les femelles vierges nourries de sang n'est pas affectée par le silence EcK2 (P = 0, 50, test exact de Fisher, bilatéral, données regroupées à partir de deux répétitions). ( e ) La réceptivité à l'accouplement n'est pas affectée chez les vierges par le silence EcK2 (P = 0, 98, test de Cochran – Mantel – Haenszel, bilatéral). ( f ) La ponte est fortement induite chez les vierges lorsque EcK2 est réduit au silence avant l'alimentation sanguine (en haut) (P = 3,30e-06, test Cochran – Mantel – Haenszel, bilatéral, les données provenaient de quatre répétitions), mais pas lorsque cela la kinase est réduite au silence après l'alimentation sanguine (en bas) (P = 0, 94, test de Cochran – Mantel – Haenszel, bilatéral). ( g ) L'expression d'EcK2 n'est pas supprimée par l'injection de 20E ou 3D20E par rapport aux témoins injectés à 10% d'EtOH. Les valeurs d'expression ont été normalisées par rapport au gène domestique RpL19 dans les échantillons respectifs avant de calculer les changements de pli (moyennes ± sem, tests t non appariés, bilatéraux, 20E : P = 0,46, 3D20E : P = 0,85). Dans tous les panels : n indique le nombre d'échantillons de moustiques biologiquement indépendants, ns = non significatif. * P < 0,05, ** P < 0,01, *** P < 0,001, **** P < 0,001. Les données provenaient de trois répétitions biologiques dans tous les panels, sauf indication contraire

Données source

Images non recadrées utilisées pour générer la Fig. 2d.

Liste des protéines transférées des mâles à l'oreillette femelle lors de la copulation (éjaculome). Voir Fig. 2c et Méthodes pour plus de détails. L'abondance des protéines est indiquée comme NSAF sur deux répétitions sur trois points dans le temps.

Liste des protéines détectées dans les MAG par MS. L'abondance des protéines est indiquée comme NSAF sur trois répétitions.

Séquences de constructions d'ARNdb (séquences spécifiques au gène cible).

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Réimpressions et autorisations

Peng, D., Kakani, EG, Mameli, E. et al. Un stéroïde mâle contrôle le comportement sexuel des femelles chez le moustique porteur du paludisme. Nature 608, 93–97 (2022). https://doi.org/10.1038/s41586-022-04908-6

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Reçu : 24 janvier 2022

Accepté : 25 mai 2022

Publié: 06 juillet 2022

Date d'émission : 04 août 2022

DOI : https://doi.org/10.1038/s41586-022-04908-6

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