Effet de l'hormonothérapie sur les modifications otoconiales causées par une carence en œstrogènes

Rapports scientifiques volume 12, Numéro d'article : 22596 (2022) Citer cet article

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Le vertige positionnel paroxystique bénin (VPPB) est associé à la ménopause et/ou à l'ostéopénie. Des modifications morphologiques de la couche otoconiale ont été rapportées après une ovariectomie (OVX). De plus, l'hormonothérapie substitutive diminue le risque de VPPB. Cependant, les connaissances concernant l'effet de l'hormonothérapie sur les modifications otoconiales causées par une carence en œstrogène sont limitées. Nous avons cherché à examiner l'effet de l'hormonothérapie sur les modifications otoconiales causées par une carence en œstrogène. Nous avons émis l'hypothèse que l'hormonothérapie pourrait réduire les modifications otoconiales causées par l'OVX. Des souris C57BL/6 âgées de huit semaines ont été réparties en quatre groupes : opération simulée avec implantation de véhicule (sham + v), OVX avec implantation de véhicule (OVX + v), OVX avec implantation d'œstradiol (E2) (OVX + E2 ), et OVX avec implantation de groupements raloxifène (RAL) (OVX + RAL). Le volume de la couche otoconiale a été mesuré par micro-CT à 4 semaines après OVX ou l'opération fictive. Les bulles otiques ont été retirées ; l'immunohistochimie a été réalisée pour le récepteur des œstrogènes alpha et 4-hydroxynonenal. Le volume de la couche otoconiale était significativement plus élevé dans le groupe OVX + v que dans le groupe sham + v. E2 et RAL ont considérablement réduit ces changements dans la couche endométriale. La coloration du récepteur des œstrogènes alpha et 4-hydroxynonenal était plus forte dans le groupe OVX + v que dans le groupe sham + v mais égale dans les groupes sham + v, OVX + E2 et OVX + RAL. Ces résultats indiquent que E2 et RAL sont efficaces contre les modifications morphologiques de la couche otoconiale causées par une carence en œstrogène via la réduction du stress oxydatif.

Le vertige positionnel paroxystique bénin (VPPB) est un trouble vestibulaire courant. Une attaque BPPV typique est déclenchée par un mouvement horizontal ou vertical de la tête. Plusieurs patients affirment qu'une crise de vertige grave survient lorsqu'ils se couchent, se retournent ou s'assoient dans leur lit. L'incidence cumulée du VPPB au cours d'une vie est de près de 10 % à l'âge de 80 ans1. L'étiologie largement acceptée du VPPB est que les débris otoconiaux délogés de l'utricule flottent dans l'endolymphe et sont piégés dans le canal semi-circulaire. Le changement de position de la tête se traduit par le mouvement des débris otoconiaux par gravité et suit un flux endolymphal anormal, conduisant à un signal de cupule inapproprié, qui provoque finalement une crise de vertige. L'évolution naturelle du VPPB sans thérapie de repositionnement canalaire entraîne une rémission spontanée pendant plusieurs semaines2. La procédure de repositionnement du canalith est souvent pratiquée chez les patients atteints de VPPB. Le taux de guérison de la procédure de repositionnement du canalith a été rapporté comme étant plus élevé (94,2 %) par rapport à celui de l'absence de traitement (36,4 %), et le taux de rechute est de 3,8 % dans les 6 mois3. Malgré son effet à court terme, il a été rapporté que 33,8 à 50 % des patients atteints de VPPB ont une récidive dans plusieurs années4,5,6,7, et que le VPPB altère la qualité de vie des patients8. Cependant, il n'y a pas de traitement standard pour le VPPB.

Selon des études antérieures, le VPPB est plus fréquent chez les femmes d'âge moyen9, et l'hormonothérapie substitutive diminue son risque10. De plus, il a été rapporté que les patients atteints de VPPB ont tendance à avoir une faible densité minérale osseuse et de faibles concentrations sériques de vitamine D6,11,12,13,14,15,16, et ceux qui ont une récidive avaient un niveau inférieur de vitamine D que le groupe sans récidive6,12,15,17. Ces études suggèrent que le VPPB est lié à des conditions post-ménopausiques ou à une perturbation du métabolisme osseux. Dans des études animales antérieures, l'ovariectomie bilatérale (OVX), qui induit une carence en œstrogène et l'ostéoporose, a provoqué des changements morphologiques dans l'otoconia18,19,20. Il a également été rapporté qu'une supplémentation en phytoestrogènes prévient les modifications otoconiales induites par OVX18. Il a été démontré que les œstrogènes ont des propriétés antioxydantes21, tandis que d'autres études ont rapporté que le VPPB est associé au stress oxydatif22,23,24. Cependant, aucune étude n'a étudié l'effet des œstrogènes ou des médicaments contre l'ostéoporose sur les modifications de l'otoconie dues à une carence en œstrogènes ainsi que la relation entre la carence en œstrogènes et le stress oxydatif dans l'utricule. C'est pourquoi nous nous sommes efforcés d'examiner cette question dans cette étude.

L'œstrogène est une hormone stéroïde et agit comme un facteur de transcription par l'intermédiaire du récepteur des œstrogènes (RE), qui est l'un des récepteurs nucléaires25. L'administration d'oestrogène est appliquée aux symptômes climatériques26. Cependant, l'administration d'œstrogène pour le traitement de l'ostéoporose post-ménopausique est controversée27,28,29. Pour un tel traitement, l'administration de raloxifène (RAL) est largement proposée. RAL est un modulateur ER sélectif (SERM). De plus, c'est un agent non stéroïdien qui se lie à ER27. Son action agoniste ou antagoniste varie selon les tissus organiques30. Cependant, on ne sait toujours pas si RAL agit comme un agoniste ou un antagoniste dans l'oreille interne. Pour examiner cette question, dans cette étude, nous avons choisi RAL pour le traitement de l'ostéoporose. Notre hypothèse était que les œstrogènes ou les médicaments contre l'ostéoporose pourraient prévenir les modifications otoconiales causées par une carence en œstrogènes en réduisant le stress oxydatif. Cette étude peut fournir des informations utiles concernant les options de traitement pour prévenir l'apparition du VPPB.

La figure 1 montre les mesures du poids utérin pour chaque groupe à 4 semaines après l'opération. Les poids utérins étaient de 86,4 ± 39,4 mg, 12,0 ± 3,0 mg, 217,7 ± 30,1 mg et 25,8 ± 4,4 mg, dans le sham + véhicule (sham + v), OVX + véhicule (OVX + v), OVX + Estradiol (OVX + E2) et OVX + Raloxifène (OVX + RAL), respectivement. Le poids de l'utérus dans le groupe OVX + v était significativement inférieur à celui du groupe sham + v (p < 0,001). Le poids utérin du groupe OVX + E2 était significativement plus élevé que celui des groupes OVX + v (p < 0,001) et OVX + RAL (p < 0,001). Ces données ont montré que l'OVX était correctement réalisée, que le culot d'estradiol était absorbé par la souris et que le culot de raloxifène n'affectait pas fortement l'utérus.

Poids de l'utérus (chaque n = 9–15). Le poids de l'utérus a diminué après l'ovariectomie (OVX). L'administration d'estradiol (E2) a significativement augmenté le poids de l'utérus par rapport à OVX avec véhicule (p < 0,001). Le poids de l'utérus était significativement plus élevé dans le groupe OVX + raloxifène (RAL) que dans le groupe OVX + v (p = 0,002). (ANOVA : p < 0,001, * : p < 0,01).

La figure 2 montre les densités minérales osseuses totales (DMO) des fémurs de chaque groupe à 4 semaines après l'opération. Les DMO fémorales étaient de 28,8 ± 1,0 mg/cm3, 27,3 ± 0,7 mg/cm3, 36,7 ± 1,0 mg/cm3 et 31,2 ± 1,2 mg/cm3 pour le simulacre + v, OVX + v, OVX + E2 et OVX + RAL groupes, respectivement. La DMO était significativement plus faible dans le groupe OVX + v que dans le groupe sham + v (p < 0,001). Les DMO étaient significativement plus élevées dans les groupes OVX + E2 et OVX + RAL que celles du groupe OVX + v (les deux p < 0,001). Ces données ont démontré que les administrations d'estradiol et de raloxifène étaient efficaces pour le métabolisme osseux.

Les densités minérales osseuses (DMO) des fémurs mesurées par DEXA (chaque n = 9–25). Les DMO des fémurs étaient significativement plus faibles dans le groupe OVX + v que dans le groupe sham + v (p < 0,001). L'administration d'estradiol ou de raloxifène a significativement augmenté la DMO des fémurs par rapport à ceux du groupe OVX + v (p < 0,001 et p < 0,001, respectivement). (ANOVA : p < 0,001, * : p < 0,01).

La figure 3 montre le volume de la couche otoconiale de l'utricule obtenu par micro-CT (µCT) pour chaque groupe à 4 semaines après l'opération. Les volumes de la couche otoconiale de l'utricule étaient de 481 272,0 ± 19 998,2 µm2, 511 274,3 ± 20 755,1 µm2, 472 776,9 ± 29 765,6 µm2 et 483 702,3 ± 21 973,8 µm2 pour le sham + v, OVX + v, OVX + E2 et OVX + groupes RAL, respectivement. Le volume de la couche otoconiale de l'utricule était significativement plus élevé dans le groupe OVX + v que dans le groupe sham + v (p < 0,001), alors qu'il n'était pas significativement différent dans les groupes sham + v, OVX + E2 et OVX + RAL .

Le volume de la couche otoconiale de l'utricule a été mesuré à l'aide d'un micro-CT scan (chaque n = 10–26). Le volume de la couche otoconiale de l'utricule dans le groupe OVX + v était significativement plus élevé que celui du groupe sham + v (p < 0,001). Les volumes des couches otoconiales de l'utricule dans les groupes OVX + E2 et OVX + RAL étaient significativement inférieurs à ceux du groupe OVX + v (p = 0,007 et p = 0,04, respectivement) (ANOVA : p < 0,001, * : p < 0,01, ** : p < 0,05).

L'analyse de l'expression différentielle de l'ARNm total dans l'utricule a été réalisée. Après avoir obtenu les résultats du volume de la couche otoconiale, les données du groupe OVX + v ont été comparées à celles des groupes sham + v, OVX + E2, OVX + RAL. En comparaison entre les groupes OVX + E2 et OVX + v, l'expression de Gstp2 dans le groupe OVX + E2 était significativement plus élevée, et les expressions de Orc8, Amd2, Mettl16, Slc35b1, Cog5, Wdr41, Sra1 et Stard8 dans l'OVX + groupe E2 étaient significativement plus faibles. En comparaison entre les groupes OVX + RAL et OVX + v et entre les groupes sham + v et OVX + v, l'expression du gène Gstp2 s'est avérée significativement plus élevée dans les groupes OVX + RAL et sham + v. Comme mentionné ci-dessus, l'expression du gène Gstp2 était significativement plus faible dans le groupe OVX + v que dans les autres groupes (Figs. 4 et 5). Gstp2 code la glutathion S-transférase (GST) pi2. GST pi2 (GSTP) est une enzyme de détoxification de phase II qui peut détoxifier les espèces réactives de l'oxygène ou les composés toxiques endogènes et exogènes31.

Le diagramme de Venn pour l'expression de l'ARNm dans l'utricule de souris. Le diagramme de Venn pour la différence d'expression de l'ARNm dans l'utricule du groupe fictif + véhicule, OVX + estradiol et OVX + RAL par rapport au groupe OVX + véhicule sous un taux de fausse découverte de 0,05 (chaque n = 5). Seule l'expression de Gstp2 a significativement diminué dans le groupe OVX + véhicule par rapport à celles des autres groupes.

L'expression de Gstp2 dans l'utricule (chaque n = 5). L'expression de Gstp2 dans le groupe OVX + véhicule était significativement plus faible que celles des autres groupes (taux de fausse découverte [FDR]-p < 0,001 vs groupe sham + véhicule ; FDR-p = 0,02 vs groupe OVX + estradiol ; FDR- p = 0,003 vs groupe OVX + raloxifène).

Une intensité plus élevée de l'ER alpha (ERα) au niveau de l'utricule a été observée pour le groupe OVX + v que pour le groupe sham + v, et le traitement par l'estradiol ou le raloxifène l'a diminué au niveau observé pour le groupe sham + v (Fig. 6). De plus, l'intensité du 4-hydroxynonénal (4-HNE) était nettement plus élevée dans le groupe OVX + V que dans les autres groupes. En particulier, le 4-HNE est un métabolite de la peroxydation lipidique et est connu pour être un marqueur du stress oxydatif32.

L'immunohistochimie de l'utricule. La coloration du récepteur alpha des œstrogènes (ERα) et du 4-hydroxynonénal (4-HNE) était nettement plus forte dans le groupe OVX + véhicule que dans le groupe simulé + véhicule. La coloration de l'ERα et du 4-HNE dans les groupes OVX + estradiol et OVX + raloxifène était inférieure à celle du groupe OVX + véhicule et égale à celle du groupe simulé + véhicule.

Dans cette étude, le volume de la couche otoconiale de l'utricule a augmenté de manière significative par OVX, entraînant une carence en œstrogène. L'administration d'E2 ou de RAL a empêché ces modifications morphologiques de la couche otoconiale causées par OVX. L'analyse RNA-seq a révélé que l'expression de Gstp2, qui code pour GSTP, a significativement diminué dans le groupe OVX + v. L'analyse immunohistochimique a montré que les expressions de ERα et 4-HNE étaient plus élevées dans le groupe OVX + v que dans les autres groupes. Ces résultats suggèrent que l'administration d'E2 ou de RAL était efficace pour réduire les modifications morphologiques de la couche otoconiale de l'utricule causées par une carence en œstrogène en supprimant le stress oxydatif via les RE.

Un travail antérieur a rapporté qu'OVX induisait une otoconia large et lâche19 ainsi qu'un volume plus élevé de couche otoconiale dans l'utricule20. Nos conclusions du groupe OVX + v appuient celles des rapports susmentionnés. Il est à noter que E2 et RAL suppriment ces modifications de la couche otoconiale dues à OVX. Bien que nos données aient montré le changement d'expression de ERα, nous n'avons pas mesuré ERß puisque l'étude précédente avait montré que les œstrogènes régulaient l'expression de ERα alors que ERß était stable dans l'oreille interne33. Cependant, on ne sait toujours pas comment ERα et ERß fonctionnent pour maintenir la structure de l'utricule. D'autres études sont nécessaires pour étudier l'association de la carence en œstrogène avec ERα ou ERβ.

L'analyse RNA-seq a révélé que l'expression de Gstp2 était significativement plus faible dans le groupe OVX + v que dans les autres groupes (Figs. 4 et 5). Gstp2 GSTP, un membre de la famille GST. Les GST sont des enzymes de phase II qui détoxifient les xénobiotiques endogènes ou exogènes pour protéger les cellules31. Les GST catalysent la conjugaison des électrophiles et provoquent un dysfonctionnement cellulaire avec le glutathion. Les conjugués de glutathion générés sont éliminés de manière extracellulaire par un transporteur, qui est une protéine multirésistante aux médicaments qui protège les cellules contre les dommages34,35. En plus de cette désintoxication, il a récemment été rapporté que le GSTP régule les voies de signalisation des kinases de stress36,37,38. Jun-terminal kinase (JNK) est une kinase de stress représentative qui est déclenchée par le stress, tel que le stress oxydatif, le choc de la tête et les cytokines inflammatoires39,40,41. GSTP forme un complexe avec JNK tout en préservant l'activité JNK de base. Le stress oxydatif, les cytokines ou les médicaments entraînent la décomposition du complexe GSTP-JUN et l'activation de la signalisation JNK, entraînant l'apoptose ou la prolifération36,39,42. Muthusami et al. ont rapporté que OVX induit une altération du système antioxydant, y compris GST43. Nos résultats suggèrent que la carence en œstrogène diminue l'expression de GSTP, conduisant à une accumulation intracellulaire de composants oxydatifs.

L'intensité de coloration de 4-HNE et ERα dans l'utricule était plus forte dans l'OVX + v que dans les autres groupes (Fig. 5). La forte intensité de ERα dans le groupe OVX + v peut représenter une rétroaction de la carence en œstrogène. En particulier, le 4-HNE est un métabolite de la peroxydation lipidique et un marqueur de stress oxydatif bien connu32. Des études antérieures ont démontré que la ménopause induit une augmentation du stress oxydatif et diminue l'activité antioxydante43,44,45,46,47,48,49. De plus, l'hormonothérapie substitutive44,45,46,47 ou la supplémentation en agents antioxydants48 ont été rapportées pour prévenir les effets indésirables de l'OVX. Il a également été rapporté que l'œstrogène a des propriétés antioxydantes indépendantes de l'ER21,50,51. Ces études ont révélé une forte relation entre les œstrogènes et le stress oxydatif. Certaines études cliniques récentes ont également montré que le VPPB est associé au stress oxydatif22,23,24. Sur la base de ce qui précède, il est suggéré que le contrôle du stress oxydatif pourrait être une nouvelle approche du VPPB, en particulier pour les patientes en périménopause.

Dans cette étude, E2 et RAL étaient efficaces pour la suppression des changements morphologiques dans la couche otoconiale. Le RAL, qui est l'un des SERM, empêche les effets inutiles sur le RE dans la glande mammaire ou l'utérus30. Par conséquent, le RAL est fréquemment utilisé pour traiter l'ostéoporose ménopausique27,52. Le RAL agit sur le RE dans les os en tant qu'agoniste et dans les glandes mammaires ou l'utérus en tant qu'antagoniste49. Cela peut supprimer le risque de tumeurs induites par les œstrogènes30. Il a été rapporté que le mécanisme de cette action unique de SERM pourrait être expliqué par l'expression différentielle de ER, la conformation différentielle de ER sur la liaison au ligand et l'expression et la liaison différentielles des protéines corégulatrices dans les cellules cibles53. Il a été démontré que l'ER existe largement dans l'oreille interne54. Cependant, son action sur le RE dans l'oreille interne est inconnue. Dans cette étude, similaire à E2, RAL a empêché les changements morphologiques de la couche otoconiale causés par OVX. De plus, les résultats d'immunohistochimie ont montré que l'intensité d'OVX + E2 était presque la même que celle d'OVX + RAL dans l'utricule. Cependant, on ignore si le RAL agit directement sur l'oreille interne. Il est possible que l'amélioration du métabolisme osseux par l'administration de RAL puisse indirectement atténuer les modifications de la couche otoconiale causées par une carence en œstrogènes. Il a été rapporté que le métabolisme osseux est lié au métabolisme du glucose, à la lymphopoïèse et au métabolisme des graisses via les ostéocytes ou les ostéoblastes55,56. Certains facteurs sécrétés par les ostéocytes ou les ostéoblastes peuvent également réguler le métabolisme des otolithes. D'autres études sont nécessaires pour déterminer si les SERM affectent directement ou indirectement l'oreille interne.

Cette étude a plusieurs limites. Premièrement, comme les souris ne sont pas génétiquement monoclonales comme les cellules cultivées, il peut y avoir eu de faux gènes négatifs lors de l'analyse de l'ARN. De plus, un test PCR en temps réel pour valider l'expression génique altérée n'a pas été effectué. Deuxièmement, on ne sait toujours pas comment le stress oxydatif modifie morphologiquement l'otoconia. Il a été montré que les otoconia sont principalement composés de protéines constitutives, de protéines d'ancrage et de protéines régulatrices57. Le stress oxydatif peut également affecter l'expression de ces protéines. D'autres études sont nécessaires pour identifier le mécanisme moléculaire sous-jacent à l'effet du stress oxydatif sur la structure otoconiale ou l'environnement vestibulaire. Troisièmement, nous avons évalué le volume de la couche otoconiale de l'utricule en utilisant uniquement µCT et n'avons pas effectué d'autres techniques, y compris l'histopathologie ou la microscopie électronique à balayage (SEM). Nous avons précédemment signalé que le volume de la couche otoconiale mesuré à l'aide de µCT était significativement associé aux résultats de l'étude histopathologique20. Par conséquent, les résultats µCT ont été considérés comme fiables. Cependant, comme la taille du voxel dans le µCT était de 6 µm, un SEM était nécessaire pour des observations détaillées. Quatrièmement, cette étude n'a pas pris en compte le cycle œstral. Les souris ont un cycle œstral de 4 à 5 jours58. Cependant, il n'a pas été rapporté si le cycle œstral influence le système vestibulaire. Des études futures sont nécessaires pour confirmer si le cycle œstral influence la structure otoconiale. De plus, nous n'avons pas mesuré l'E2 sérique car le coût de la mesure de l'E2 est élevé. Au lieu de cela, nous déterminons indirectement le déficit en E2 en mesurant le poids de l'utérus et la DMO. Comme le poids utérin et la DMO ont tous deux diminué de manière significative par OVX dans cette étude, on pensait que les souris OVX étaient privées d'E2. Cependant, d'autres études sont nécessaires pour inclure la mesure E2. Enfin, la dose d'E2 et de RAL administrée par culot était supérieure à la dose utilisée cliniquement59,60. Dans cette étude, des pastilles ont été utilisées pour administrer E2 ou RAL afin de prévenir le stress des animaux. Cependant, d'autres études sont nécessaires pour déterminer si des doses plus faibles de ces médicaments sont efficaces pour prévenir les changements morphologiques de la couche otoconiale dus à l'OVX.

En conclusion, la carence en œstrogène a entraîné des changements morphologiques dans la couche otoconiale de l'utricule, et l'administration d'E2 ou de RAL a empêché ces changements dans la couche otoconiale. Le mécanisme sous-jacent aux effets de l'E2 ou du RAL reste inconnu. Cependant, les résultats de cette étude suggèrent que E2 et RAL réduisent le stress oxydatif. D'autres travaux sont nécessaires pour déterminer si E2 ou RAL réduisent le stress oxydatif via ER.

Le protocole d'étude a été approuvé par le comité d'éthique pour les expérimentations animales de l'Université d'Ehime (n° 05HI77-1). Toutes les méthodes ont été réalisées conformément aux directives et réglementations en vigueur. Cette étude a été menée conformément aux directives ARRIVE (https://arriveguidelines.org).

Des souris C57BL/6 J femelles ont été achetées auprès de Japan SLC (Shizuoka, Japon) et réparties au hasard dans les quatre groupes suivants : (1) opération fictive avec culot de véhicule (groupe simulacre + v), (2) OVX avec culot de véhicule (OVX + groupe v), (3) OVX avec pastille libérant du 17bêta-estradiol (OVX + groupe E2) et (4) OVX avec pastille libérant du raloxifène (RAL), qui est un SERM (groupe OVX + RAL). Les souris ont été soit opérées de manière simulée, soit ovariectomisées à l'âge de 8 semaines sous anesthésie en utilisant des injections intrapéritonéales de médétomidine (0,3 mg/kg), de midazolam (4 mg/kg) et de butorphanol (5 mg/kg). Dans la procédure d'OVX, nous avons fait une incision cutanée au bas du dos et identifié le péritoine. Ensuite, nous avons effectué une dissection du péritoine, retiré l'ovaire et enfin suturé l'incision. Chez les souris opérées de manière fictive, les ovaires ont été identifiés et non retirés, et des pastilles de véhicule ont été implantées par voie sous-cutanée immédiatement après OVX. Chez les souris OVX, les pastilles suivantes ont été implantées par voie sous-cutanée : pastille de véhicule, pastille à libération lente d'estradiol (50 µg/60 jours) ou pastille à libération lente de raloxifène (2,4 mg/60 jours) (Innovative Research of America, Sarasota, FL , ETATS-UNIS). Après une opération OVX ou fictive, les souris ont été remises dans leurs cages jusqu'à d'autres tests. Toutes les souris ont été maintenues dans le même environnement à une température de 21 à 23 ° C et avec un cycle lumière / obscurité de 12/12 h (lumières allumées de 7h00 à 19h00), et elles avaient libre accès à de la nourriture standard. et de l'eau, à volonté, à l'animalerie de l'université d'Ehime.

Les souris ont été sacrifiées à 4 semaines après l'opération OVX ou fictive, compte tenu des résultats d'une étude précédente, dans laquelle le volume de la couche otoconiale a augmenté de manière significative à 4 semaines après OVX20. Ils ont été profondément anesthésiés avec de la kétamine (200 mg/kg) et de la xylazine (20 mg/kg) et euthanasiés. Les bulles otiques ont été retirées et fixées avec une solution de paraformaldéhyde à 4 % pendant 24 h, décalcifiées avec 0,1 M d'EDTA pendant 4 jours et incluses dans de la paraffine. Les DMO totales des fémurs ont été mesurées par absorptiométrie à rayons X à double énergie avec un analyseur de minéraux osseux (DCS-600EX, Aloka, Tokyo, Japon). Le poids de l'utérus a été mesuré pour examiner les effets de l'OVX et des médicaments.

Le volume de la couche otoconiale a été évalué à l'aide de µCT (Scanco Medical, Brüttisellen, Suisse). Nous avons précédemment rapporté que le volume de la couche otoconiale obtenue à partir d'images μCT scan était corrélé avec celui obtenu dans une étude histologique20. Après avoir sacrifié les souris sous anesthésie profonde, les bulles otiques ont été retirées et fixées avec une solution de paraformaldéhyde à 4 % pendant 24 h. Les bulles otiques ont été post-fixées avec de l'éthanol à 70 % pendant 24 h, et une numérisation µCT à l'aide d'un système Scanco Medical µCT35 avec une taille de voxel isotrope de 6 µm a été réalisée. Les scans ont été réalisés avec un potentiel de tube à rayons X de 70 kVp et une intensité de 114 µA, et les images de la couche otoconiale de l'utricule ont été analysées à l'aide du logiciel ImageJ (US National Institute of Health, Bethesda, ML, USA) (Fig. 7 ). Après binarisation, la structure membraneuse de l'otoconia utriculaire a été déterminée. Les surfaces totales de la structure membraneuse de l'utricule de toutes les tranches pour les quatre groupes ont été comparées.

L'image micro-CT de l'utricule. ( a ) L'image originale de la couche otoconiale de l'utricule (flèche blanche) a été obtenue à partir d'un micro-CT scan. (b) L'image binarisée de la couche otoconiale à l'aide du logiciel Image J. Après binarisation, le volume de la couche otoconiale de l'utricule a été calculé à l'aide du logiciel image J.

Après décapitation, les bulles otiques ont été retirées. La fenêtre ovale a été soigneusement fenestrée sous l'eau et l'utricule a été disséqué. L'utricule a été rapidement stabilisé à l'aide du réactif tissulaire RNAprotect (# 76 104, Qiagen, Hilden, Allemagne) et stocké à 4 ° C jusqu'à l'extraction de l'ARN. L'ARN total a été extrait de l'utricule à l'aide du kit NucleoSpin RNA XS (#74,902.50, Macherey-Nagel, Waltham, MA, USA), selon les instructions du fabricant. La qualité de l'ARN a été vérifiée à l'aide d'un bioanalyseur Agilent 2100 (#G2939A, Agilent Technologies, Santa Clara, Californie, États-Unis), du kit pico RNA6000 (#5067–1513, Agilent Technologies) et du logiciel expert 2100 (version B.02.07, Agilent Les technologies). L'ARN total de haute qualité, qui présentait plus de 7 numéros d'intégrité de l'ARN (RIN), a été utilisé pour une analyse plus approfondie (moyenne, 7,96 ; 7,30 à 8,24). La bibliothèque RNA-Seq a été construite à partir de 1 ng d'ARN total à l'aide du kit de préparation de bibliothèque QuantSeq 3'mRNA-Seq pour Illumina (FWD) (#015.384, LEXOGEN, Vienne, Autriche). La bibliothèque construite a été séquencée à l'aide du NextSeq500 (Illumina) avec le kit NextSeq 5050/550 High Output v2.5 (75 cycles) (#20 024 906, Illumina) au Kazusa DNA Research Institute (Chiba, Japon). Les données de séquence ont été analysées à l'aide du CLC Genomics Workbench (Qiagen). En bref, le fastq a été découpé en fonction des directives du kit de construction de la bibliothèque. En particulier, les séquences adaptatrices et polyA et les nucléotides de faible qualité à l'extrémité 3' ont été supprimés. La coupe des 12 premiers nucléotides à l'extrémité 5' a été effectuée et les lectures de courte longueur inférieures à 20 nucléotides ont été supprimées de l'ensemble de données. Le fastq coupé a été mappé à la séquence de référence Mus musculus (GRCm39.105) en utilisant les paramètres par défaut. L'analyse de l'expression différentielle a été réalisée par la méthode de normalisation CPM.

Après enrobage en paraffine, coupes de bulles otiques Sects. (4 µm) ont été préparés. Ils ont ensuite été déparaffinés et réhydratés. La récupération de l'antigène a été effectuée dans un tampon d'acide citraconique (Immunosaver®, #097–06,192, Fujifilm Wako Pure Chemical Corporation) pendant 45 min dans un autoclave à 95℃. L'activité de la peroxydase endogène a été inhibée avec du peroxyde d'hydrogène à 3% pendant 15 min, et les sections ont été bloquées avec un RTU Animal Free Blocker and Diluent® (SP-5035, Vector Laboratories, Burlingame, CA, USA). Après rinçage avec du tampon phosphate salin (PBS), les coupes ont été incubées avec des anticorps polyclonaux de lapin contre ERα (1:200, #106,132-T08, Sino Biological) et 4-HNE (1:400, #bs-6313R, Bioss) pendant une nuit à 4℃. Après un nouveau rinçage avec du PBS, ils ont été incubés avec un anticorps secondaire (Histofine Simple Stain Mouse MAX-PO(R) #414,341, Nichirei Biosciences, Tokyo, Japon) pendant 1 h à température ambiante et colorés avec le chromogène DAB pendant 10 min. Après un dernier rinçage, une contre-coloration a été réalisée à l'hématoxyline de Mayer.

Les résultats sont exprimés en moyennes ± écarts-types. Les données des groupes ont été comparées à l'aide de l'ANOVA et du test Steel-Dwass avec JMP pour Macintosh (SAS Institute Inc., Cary, NC, USA). La signification statistique a été fixée à p < 0,05. Pour l'analyse de l'expression différentielle de l'ARNm, les données du groupe OVX + v ont été comparées à celles des groupes sham + v, OVX + E2 et OVX + RAL à l'aide du test t avec CLC Genomics Workbench (Qiagen). Les valeurs de p du PDF < 0,05 ont été considérées comme statistiquement significatives.

Les ensembles de données générés et/ou analysés au cours de l'étude actuelle sont disponibles dans le référentiel GEO, GSE216449 (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/query/acc.cgi?acc=GSE216449).

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Nous sommes reconnaissants au personnel de l'animalerie du Centre de soutien à la recherche avancée (ADRES) de l'Université d'Ehime pour avoir fourni des soins à nos souris.

Département d'oto-rhino-laryngologie, chirurgie de la tête et du cou, École supérieure de médecine de l'Université d'Ehime, Shitsukawa, Toon, Ehime, 791-0295, Japon

Takahiro Nakata, Masahiro Okada, Eriko Nishihara, Sawa Asoh, Taro Takagi et Naohito Hato

Département d'oto-rhino-laryngologie, Ehime Prefectural Niihama Hospital, Niihama, Japon

Takahiro Nakata

Division de physiopathologie intégrative, Proteo-Science Center, Université d'Ehime, Toon, Japon

Aoi Ikedo et Yuuki Imai

Division du soutien à la recherche médicale du Centre de soutien à la recherche avancée, Université d'Ehime, Toon, Japon

Naohito Tokunaga

Département de physiopathologie, École supérieure de médecine de l'Université d'Ehime, Toon, Japon

Yuuki Imaï

Division de la recherche sur les animaux de laboratoire, Centre de soutien à la recherche avancée, Université d'Ehime, Toon, Japon

Yuuki Imaï

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TN, MO, NH et YI ont conçu l'étude et rédigé le manuscrit. EN, SA et TT ont participé à la collecte des données. AI, NT et YI ont participé à la collecte, à l'analyse et à l'interprétation des données.

Correspondance à Takahiro Nakata.

Les auteurs ne déclarent aucun intérêt concurrent.

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Réimpressions et autorisations

Nakata, T., Okada, M., Nishihara, E. et al. Effet de la thérapie hormonale sur les modifications otoconiales causées par une carence en œstrogène. Sci Rep 12, 22596 (2022). https://doi.org/10.1038/s41598-022-27240-5

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Reçu : 18 octobre 2022

Accepté : 28 décembre 2022

Publié: 30 décembre 2022

DOI : https://doi.org/10.1038/s41598-022-27240-5

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